文档介绍：浅谈RP-HPLC方法的建立
蒋辉
防化研究院生物有机实验室
浅谈RP-HPLC方法的建立
1总论
2卓有成效的工作方法
3样品的性质和预处理
4分离的基础
5系统方法的建立
6保证柱寿命和性能的步骤
高效液相色谱法总论
绝大多数实验室中,HPLC方法的建立仍在靠经验进行
首先进行反相色谱实验,调整流动相中有机相的比例,以求得足够的分离度、合理的操作时间以及易于检测的谱带。
改用不同的色谱柱,改变温度和流动相pH值,优化筛选溶剂的配比组成,以其它溶剂代替原来有机溶剂。或者试用别的HPLC方法
卓有成效的工作方法
1 首先估价样品与分离目的(切不可低估此步的重要性)
2设计开始的分离条件,使之有可能在一两次实验中,便可能得到有希望的色谱图。
3 预测可能发生的问题,当问题出现时,能用已知的办法解决。
卓有成效的工作方法
4 有限考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。
5 应对每次实验进行设计,能提供有用信息。
6 HPLC的目的是分离,而不必使所需谱峰“过渡分离”。
样品的性质和预处理
可直接进样的样品溶液
需稀释缓冲pH或添加另一液体的溶液
能在流动相中溶解的固体
含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前将其去除的溶液
含有不容性赋性剂的混合物(动植物组织,高交联度聚合物、干性黏合剂)
绝大多数样品需经称重或稀释后进样,一般使最终样品液与流动相的成分尽量相近。
分离的基础:流动相的作用
要分离好的好,有两条途径:一是谱带窄,即柱效高;再就是谱带间距离大。
Rs=(t2-t1)/[(1/2(w1+w2)]
t1,t2 为二相邻谱带间的保留时间,w1和w2为它们基线处的峰宽。Rs为其分离度。Rs≥。
当峰发生重叠时,难以准确测量到基线处的峰宽,更的办法好是用半高处的相应峰宽1和2:
Rs= (t2-t1)/ (1+2)
Rs≥,能达到≥99%的分离度。
新柱的起始色谱图的Rs值越大,意味着该柱用此法时间越长。
Rs≤。