文档介绍：上海交通大学
硕士学位论文
小苍兰ISSR分子标记
姓名:周凌瑜
申请学位级别:硕士
专业:园林植物与观赏园艺
指导教师:刘群录
20080101
小苍兰 ISSR 分子标记

摘要

小苍兰作为世界十大切花之一,具有很高的观赏价值和经济效益。
本文采用简单重复序列间(ISSR,inter-simple sequence repeat)分子标记对
现有的 12 份小苍兰种质进行了研究,分析了其遗传多样性和亲缘关系,
为后续的小苍兰育种工作和品种保护提供理论依据。
首先,优化了小苍兰的 DNA 提取方法。在改良 CTAB 法的基础上,
将研磨粉碎的样品用 dd-H2O 水洗处理,同时在 2XCTAB 中加入
的硼砂去除样品中的酚类物质。在加入酚/氯仿/异戊醇之
前,在提取液中加入体积无水乙醇;同时在加入 2 倍体积无水乙醇
沉淀 DNA 之前,加入体积 5mol/L 氯化钠和后续 PS Erasol 处理去除
多糖类物质。DNA 中混杂的 RNA 经 RNase 水解去除。利用优化的 DNA
提取方法,对比了从小苍兰不同部位提取的 DNA 质量,发现幼嫩叶片
为最佳的取材部位。利用优化的提取方法,获得了适合 ISSR 分子标记
的高质量小苍兰 DNA,为下一步试验提供了材料。
其次,优化了小苍兰 ISSR-PCR 的反应体系。通过对比研究不同反
应体积对 PCR 结果的影响,我们选择了 25µL 的反应体系。利用五因素
四水平的正交试验,研究了镁离子浓度、dNTPs 浓度、模板 DNA 用量、
Taq DNA 聚合酶用量和引物用量对 ISSR-PCR 的影响,建立了适合小
苍兰的 ISSR-PCR 反应体系。在 25µL 的反应体系中含有 1× Taq DNA
酶配套缓冲液(10mmol/L Tris·HCl,pH 值 ,50mmol/L KCl,% Triton
X-100), MgCl2,/µL Taq DNA 聚合酶,4ng/µL 模板 DNA,
µmol/L 引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各。同时,通
过温度梯度 PCR 确定了各引物最适宜的退火温度。该优化体系的建立
为下一步对小苍兰进行 ISSR 分子标记奠定了基础。
I
最后,利用优化的 ISSR-PCR 反应体系,对 12 份小苍兰种质进行
了 ISSR 的分子标记研究。数据经 NTSYSpc 版分析处理,根据 Nei’s
遗传距离建立了 12 份不同花色小苍兰的聚类图和遗传距离图。根据聚
类图可以将材料划分为 4 个类群:白色一组,大红重一组,黄色系和红
色系一组,紫色系一组。从分子水平上说明这 12 份小苍兰种质的遗传
背景相对比较简单,遗传基础比较窄。

关键词:小苍兰,分子标记,ISSR
II
INTER-SIMPLE SEQUENCE REPEAT
(ISSR) ANALYSIS OF FREESIA REFRACTA

ABSTRACT

Freesia refracta, one of most famous cutting flowers of the world,has
high ornamental and economic values. The ic diversity and
relationships of 12 freesia varieties were investigated with ISSR
(inter-simple sequence repeat) to provide the theoretical base for the
breeding and variety protection of F. refracta.
Firstly, the method of DNA extraction from F. refracta was optimized.
On the basis of CTAB method,the ground samples were washed with
dd-H2O to elute the pounds before adding 2 x CTAB extraction
solution containing borax. And the harides were
removed by adding volume o