文档介绍：上海第二医科大学
博士后士学位论文
RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究
姓名:程计林
申请学位级别:博士后士
专业:内科学(消化系病)
指导教师:李定国;陆汉明
墨塑堡笪细胞生物值星塑控盆子和缝盒基甩的功能研究目的;ひ蜃维化的靶位点。ü芯縍经磷酸一桓事短一课题研究摘要,依赖性酪氨酸磷酸化信号转导通路有关。捌鹤博蟪碳屏至O档际疃ü属了‘‘橄赴蜃映易澹唤鲇跋煜赴鲋场⒚庖吖δ堋⑸发育,也促进细胞外基质,合成和整合素表达。最新研究发现阋恢种匾5慕悄こ杉∠宋赴只猄泶锏挠盏家蜃印榈糰—虮泶锏贾录∠宋钏胞的转化,这‘功能与精一惶於彼—各种病闲缦赴榈嫉南赴咀鞲铡⒁┪铩⒒Ф疚铩⒅峦磍笥琛病毒和自身免疫疾病等鸬南赴±硭鹕撕退繧、:的重要机制,病毒感染、酒精、药物等外来因素导致肝细胞凋亡。凋亡的肝细胞分泌琓口作用于肝星状细胞,,使之成为激活的肌纤维细胞,肌纤维细胞又分泌徊降贾赂细胞的凋ⅲ海钪招纬筛蜗宋⒏斡不锕δ苄藕诺拇递:蔷要其下游介质如芴蛋白。因此,细胞内畔⒎謗通路有可能成为蓖要的治疗肝纤,修饰或其缀合藕糯ǖ家种频鞍譙基因刈和。一平滑鞍蚐,骱奘蜗赴镄畔⒌骺胤肿雍妥汉匣砸种聘蜗宋纳柘爰捌涑醪窖芯痓琓琓—,猘,
/方法τ没Х椒ń玀与墓布劢岷衔8春戏肿印J紫龋菇≧—虮泶镌靥錺~猄。包括设计袢缀合颍玆虿迦胫柿T村照组患覶岱,和其他处理籘/;柿6哉兆纯化的未插入猄基因片段的单细胞生物信息网络功能的影响,町蠼发现调控信号传递的新方法和治疗肝纤维化的新途径。幌趸交虎蛞籇事短橇姿峄僭趌獵、笃骨馄脱去硝基,得到的话被交一磷酸一甘露糖再通过二氯硫化碳激发与慕岷稀>赴Ш投镅笛榧觳釸纳特异性杭覴肽引物,从鼠肝提取ü孀B家欢嗑酶链反应体,克隆筛选、双酶切鉴定、测序,用无内毒素质粒提取纯化猲重组质粒。赴笛椋捍诱J蟾畏掷際置入孔板中培养小时,谏ぷ刺己茫隹椎壮ぢ赴写ù绦嘌小时待孔底再次长满细胞,每组,给予不同处理。单纯细胞培养6哉兆只加纯柿痬ü侍褰榈甲H綡术后,加入脂质体介导猂—柿痬H綡术后,加痠籅褐侍褰榈紁—玈质粒活性。,/痬;/\猵\,厂
萦盟ǹ固逖胍酶免疫测定法检测上述各实验组培养上清橄榄油溶液埽越⒏斡不疭坌源笫竽P停缓螅婊治。四周后,大鼠均被摘眼球取血,分离血清,测定徒。并用紫外扫描计算机图像分析仪,/。虑用分别选择在柿P蛄泻铝兄械纳稀游,物,通过椒ḿ觳庾H綡术欠翊嬖趐—猂—⒃葱曰祝挥τ肦狿检测外源性垦凶猄皿谧H綡术的表达;应用郾0纺旱缬,分析转染蠷—鞍椎谋泶铮中的徒涸镅笛椋悍肿椋只大鼠用作单纯饲养,不给任何处理作为正常对照组。另只大鼠给予腹部皮下注射%四氯化碳。绀,每组唬诩绦鳦。腹部皮下注射的同时,给予无内毒素纯化质粒猣猂—蛏硌嗡谑蟠笸热霾课患∪饽谧射。次。模型对照组硌嗡∽,猂—弈诙舅纯化质粒,猂无内毒素纯化质粒原;留取鼠肝和注射部位组织,、苦味酸性复红染色染色⒚庖咦榛徒涸!年纤染色,和琑狿检测注射部位及肝组织中的外源性猲—猄质粒蚏—图像分析系统对反应产物进行半定量处结果转染螅尤隩騂蝉。猄
押铣蒔一氨基苯基一涣姿嵋虎蛞籇回ヂ短谴制罚写徊酱半定量结果煅橄允荆H綡术酰胺凝胶电泳,考马斯亮蓝染色显示,。竦猄移巍;竦貌迦隦—基网』段的重组猲—猄质粒。双酶切鉴定为的片段,核苷酸序列测序结果与设计引物参照的基因大鼠嗦区全序列比较,两者的同源性为.%。赴笛椋经提取猲~玈质粒转染螅琍产物电泳结果显示,猲—猄转染写嬖谝惶的猂—蜓粜蕴醮醋H鞠赴蓿崾緋—猄已导入受体细胞。—锏缬鞠允荆琾—柿WH綡术醮ü馇慷让飨愿哂谖醋H綡术,提示泶镆欢康,而转染写嬖赗和泶的叠加,猄的表达强于细胞M枷笊璺治谋泶锖臀醋H綡术谋泶铮钜烊阎籲—猄质粒转染牧呀馕铮璖聚丙烯样品中均可见到大约的蛋白带,经过分析证明其为匾煨蕴醮枷竺芏鹊氖面积与灰度治龌竦玫
,【徒涸揭泊嬖谙灾圆钜动物的‘般情况:与正常对照组比较,只肝硬化模型鼠索状向四周放射样排列,板问有不规则肝窦,肝小叶内网状纤维支架完整,分布规律,无胶原纤维存在。肝硬化模型对照组肝组织脂肪变’陀、坏死、炎性细胞浸润、汇管区扩大、汇管区胶原沉积及部分肝组假肝小叶的结构基本正常,未被分割和改建,无假小叶形成。~,而治疗组较模型组明显减轻,橛纸螦组肝纤维化程度稍±。进一步提示衷达·定量的H綡术中存在蚐表达的存加,.±.±锸笛椋长均停滞;其身长、体形和体重均明显小于正常对照组单纯饲养鼠形肥硕,体重。肝组织病理学结果:正常组肝脏肝板以中央静脉为中心呈条织假小叶形成,基因治疗组虽然