文档介绍：生物化学实验 Biochemical Experiment
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实验成绩评分方法
实验预****情况(10%)
实验操作情况(30%)
实验报告情况(30%)
实验考试成绩(20%)
实验素质(遵守实验室规则和道德行为)(10%)
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本学期实验课安排
9月11日
生化实验常规仪器的使用 4学时
9月18日
蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐 6学时
9月25日
醋酸纤维膜电泳鉴定蛋白质 6学时
10月9日
蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法和Fulin酚法) 8学时
10月16日
蛋白质等电点的测定-等电聚焦 8学时
10月23日
丹磺酰化分析蛋白质N-末端氨基酸 I 6学时
10月30日
丹磺酰化分析蛋白质N-末端氨基酸 II 6学时
11月6日
猪肝DNA的制备 6学时
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11月13日
DNA定量和纯度测定 6学时
11月20日
DNA变形和复性以及Tm值得测定 6学时
11月27日
蔗糖酶的制备及各步比活力的测定 8学时
12月4日
底物浓度对酶活性的影响及km值测定 8学时
12月11日
正交法寻找蔗糖酶的最适反应条件 8学时
12月18日
氨基转换反应的定性鉴定 6学时
12月25日
LDH在不同组织中的表达分析-非变性聚丙烯酰***凝胶电泳 10学时
2007年1月
综合设计实验(考试) 6学时
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有关网址和参考书目
ebio/
chemistry/bioc800/
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赵永芳. .
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2、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐
蛋白质的盐析分级分离
SephadexG-25脱盐
盐离子的跟踪检测
UV检测蛋白质
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蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术
材料(取材一定要新鲜,在低温下操作)
破细胞(匀浆器,研钵,超声波,反复冻融,化学方法,酶解等)
蛋白质提取(根据物质的性质,水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂)
蛋白质分级分离(盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点分离)
进一步纯化(透析、柱层析:分子筛、离子交换、亲和层析、HPLC)
鉴定(电泳:薄层电泳(纸,NC膜)、凝胶电泳(PAG,琼脂,淀粉);结构分析;活性分析;呈色反应)
含量测定(fonlin酚法、考马斯亮蓝G250法)
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蛋白质的分级分离(粗分级)
一、盐析沉淀分离
1、盐溶和盐析现象:低盐浓度下蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而增加;盐浓度升高到一定程度后,蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而减小析出。
2、盐的选择:通常采用中性盐,硫酸铵、硫酸镁、***化钠、磷酸钠等。
3、硫酸铵浓度的计算与调整:
(1)加硫酸铵饱和液:V=V0(S2—S1)/(1—S2);
(2)加固体硫酸铵:t=G(S2—S1)/(1—AS2)
V为所加饱和硫酸铵体积; V0 为原溶液体积; S2 为需达到的硫酸铵饱和度; S1 为原溶液硫酸铵饱和度;G和A为常数,0 时G为507,;20 时,G为533,。t为每升加入的克数。
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二、有机溶剂沉淀分离
有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过滤或离心分离,分辨率好,但容易使蛋白质变性,通常在低温下进行。
三、选择性沉淀法(等电点、热变性、酸碱变性等)
四、吸附法
五、