文档介绍：主要内容

DNA提取原理
DNA提取方法
操作注意事项

PCR体系和循环条件
PCR操作步骤
操作注意事项

凝胶电泳原理
电泳方法步骤
操作注意事项

DNA提取原理
DNA提取方法
操作注意事项
基因组DNA提取原理
既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,
又要保持DNA分子的完整。
仪器准备:
台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、移液器、离心管(灭菌)、吸头(灭菌)、镊子(灭菌)、离心管架
试剂准备:
试剂盒、无水乙醇等
基因组DNA提取
试剂盒
试剂盒内容
操作步骤(重点)
向52ml的缓冲液GD中加入68ml无水乙醇,并标记;向50ml的缓冲液PW中加入200ml无水乙醇,并标记;
取200ul全血,加入20ul的蛋白酶K溶液,混匀;
加入200ul缓冲液GB,充分颠倒混匀,56℃放置10分钟,期间颠倒混匀数次,溶液应变清亮。
加入200ul无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
将吸附柱CB3放入收集管中准备好,将上述溶液移到吸附柱CB3中,12000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管;如果步骤5的溶液不能一次加完,可以再次重复步骤6;
向吸附柱中加500ul的缓冲液GD, 12000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管;
操作步骤(重点)
7. 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW, 12000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管;
向吸附柱中加入500ul漂洗液PW, 12000rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管;
将吸附柱和收集管再次离心, 12000rpm离心2分钟,将吸附柱至于室温放置数分钟;
将吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB,室温放置2-5分钟, 12000rpm离心2分钟,将溶液收集到离心管中;
测OD值,计算DNA浓度和纯度;或电泳估计DNA浓度。
计算公式:
OD260/OD280=-
DNA浓度(ug/ul)=OD260×50×稀释倍数/1000
OD260=
稀释倍数=250
DNA浓度=×50 ×250/1000= ug/ul
操作注意事项
避免样品反复冻融
56℃水浴摇匀可消除GB中的沉淀
使用台式离心机,室温离心