文档介绍：生物化学与分子生物学基础实验
实验一几种蛋白质定量测定方法的比较
生物化学与分子生物学基础实验
1 掌握紫外吸收法、Folin-酚试剂法(Lowry法)和考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量的原理和方法
2 掌握分光光度计的原理和使用方法
实验目的
生物化学与分子生物学基础实验
①有多少样品可供分析;
②蛋白质样品浓度大约是多少;
③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质;
④所选方法是否简单、可靠;
⑤含量测定的专一性要求是否很高。
选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑:
生物化学与分子生物学基础实验
常用的方法
物理性质:紫外吸收法
化学性质:Folin-酚试剂法(Lowry法),BCA法(Bicinchoninic acid 法),凯氏定氮法,双缩脲法(Biuret法),胶体金测定法,等等
染***质:考马斯亮蓝染色法(Bradford法)、银染法
测定绝对含量应用凯氏定氮法(蛋白质的含氮量为16%)。
生物化学与分子生物学基础实验
蛋白质在紫外光区(190nm-360nm)有两个强烈吸收峰:280nm和190nm。
280nm有吸收的电子所需能量较少,因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中,色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环,可吸收280nm波长的光子,苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关,因此相同浓度的不同种类蛋白质,其280nm的吸收值差别很大(图1)。
紫外吸收法
生物化学与分子生物学基础实验

图A是15μg /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱,缓冲液为:% Brij35, K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。图B是10μg /ml RNA和DNA的吸收光谱。
生物化学与分子生物学基础实验
缺点:
干扰测定的影响因素多,尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收, ,必须严格控制样品溶液的pH和化学组成,使待测样品和标准样品的实验条件一致。
敏感度低,要求样品的浓度较高,量较大。
用标准曲线法测定蛋白质含量时,对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,误差较大。
紫外吸收法
生物化学与分子生物学基础实验
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
标准蛋白溶液(ml)
0

0
双蒸水(ml)

0
0
蛋白质含量(mg/ml)
0

未知蛋白溶液(ml)
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A280
操作步骤
紫外吸收法