文档介绍：CRISPR-Cas9大全:基因敲除、点突变、基因插入
2015-10-15
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CRISPR-Cas系统简介
CRISPR-Cas系统的应用技术
CRISPR-Cas系统的应用前景
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1. CRISPR-Cas系统简介
CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年,日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列,随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中,2002 年,正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列
2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源,推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。
2007 年,Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入侵;2008 年,Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移,首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2013 年初,MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口,从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定点插入。
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-Cas系统的结构
CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇,前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶,能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似,但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
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CRISPR-CAS 系统的作用机理
CRISPR 的高度可变的间隔区的获得
首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM(NGG序列),将临近 PAM 的序列作为候选protospacer;然后在 CRISPR 基因座的5'端合成重复序列;最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间
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CRISPR-CAS 系统的作用机理
CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)
当该噬菌体再次入侵细菌时,CRISPR 簇首先转录为长的crRNA前体,然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。
CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰
crRNA 结合相关的Cas 蛋白后,形成crRNA-Cas 蛋白复合体,通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合,随后Cas 蛋白对目标DNA 进行断裂和降解。
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CRISPR-CAS 系统的作用机理
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2、CRISPR-Cas系统的应用
CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术
基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。
这种技术的原理是构建一个人工内切酶,在预定的基因组位置切断DNA,切断的DNA在被细胞内的