文档介绍：CRISPR-Cas9 大全: 基因敲除、点突变、基因插入 2015-10-15 ?CRISPR-Cas 系统简介?CRISPR-Cas 系统的应用技术?CRISPR-Cas 系统的应用前景 1. CRISPR-Cas 系统简介 CRISPR-Cas 系统的研究历史?1987 年,日本课题组在 K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列,随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中, 2002 年, 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列?2005 年发现 CRISPR 的间隔序列(spacer) 与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源,推测细菌可能通过 CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。?2007 年, Barrangou 等首次发现细菌可能利用 CRSPR 系统抵抗噬菌体入侵; 2008 年, Marraffini 等发现细菌 CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移, 首次利用实验验证了 CRISPR 系统的功能?2013 年初, MIT 的研究组首次利用 CRISPR/Cas9 系统对人 293T 细胞 EMX1 和 PVALB 基因以及小鼠 Nero2A 细胞 Th 基因实现了定点突变。同年 Mali 利用 CRISPR/ Cas9 在人 293T 细胞和 K652 细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口,从而激活细胞的 DNA 修复机制高效介导外源基因定点插入。 CRISPR-Cas 系统的结构?CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列 S( spacers) 间隔排列而成的 CRISPR 簇, 前导序列 L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因 cas 。 Cas 蛋白是一种双链 DNA 核酸酶,能在 guide RNA 引导下对靶位点进行切割。它与folk 酶功能类似,但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。 CRISPR-CAS 系统的作用机理?CRISPR 的高度可变的间隔区的获得首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM (NGG 序列),将临近 PAM 的序列作为候选 protospacer ;然后在 CRISPR 基因座的 5'端合成重复序列;最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间 CRISPR-CAS 系统的作用机理? CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)当该噬菌体再次入侵细菌时, CRISPR 簇首先转录为长的 crRNA 前体,然后逐步被加工成小的成熟的 crRNA 。?CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的 Cas 蛋白后,形成 crRNA-Cas 蛋白复合体,通过碱基互补配对精确地与目标 DNA 相结合,随后 Cas 蛋白对目标DNA 进行断裂和降解。 CRISPR-CAS 系统的作用机理 2、CRISPR-Cas 系统的应用 CRISPR-Cas 9介导的基因组精确编辑技术?基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对 DNA 序列进行改造的遗传操作技术。?这种技术的原理是构建一个人工内切酶,在预定的基因组位置切断 DNA , 切断的 DNA 在被细胞内的 DNA 修复系统修复过程中会产生突变,从而达到定点改造基因组的目的。?通过修复途径,基因组编辑技术可以实现三种基因组改造,即基因敲除, 特异突变的引入和定点转基因?基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一,也可被用于人类遗传性疾病的治疗,因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点 CRISPR-Cas 9介导的基因组精确编辑技术 CRISPR s技术是一种由 RNA 指导 Cas 蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 Mali 等人利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的 CRISPR 相关蛋白 Cas9 ,在一段人为重组的 sgRNA( small-guide RNA) 的引导下,针对小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程RNA 进行 DNA 改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。例子:基因敲除的实验过程 1、在把基因序列中寻找NGG 序列获得其附近 20多个碱基的序列, 与tracrRNA 序列融合, 设计出 sgRNA 并合成该序列。 2、将该序列以及 cas9 基因连入如图所示载体。 3、转化感受态,质粒小提,测序验证。 4、细胞培养与细胞转染5、敲除效果检测。 6、建立稳定敲除的细胞株