文档介绍：化学生物学论文
班级:2009级化学生物学班
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酶结构的研究

摘要:
酶是生物体内具有催化活性的生物大分子,生命活动的正常进行必须有酶的参与。酶催化效率高,选择性好,作用条件温和而受到而受到众多科研工作者的青睐。随着酶应用领域更神更广,将在能源节约,医学等领域取得长足的进步。酶性质研究工作,结果的研究首当其冲。酶的化学本质是蛋白质和RNA,以蛋白质酶为主,所里这里只描述蛋白质酶结构的1-4级机构及其研究方法,并唾液淀粉酶为例进行进一步的说。
一:酶结构研究的内容:
前已述及,酶的化学本质是蛋白质,酶空间结果的研究与蛋白质结构的研究基本相同。蛋白质从空间上分为1-4级结构。蛋白质从肽链的结构上看,是由一系列氨基酸脱水缩合通过肽键连接在一起,形成长链。在研究不同层次的结构时采用不同的结构单元,在研究一级结构是是以氨基酸残基为基本结果单元进行的;空间立体结构的研究是以肽平面为基本单元展开的。下面就对1-4级结构研究的具体内容和相关方法逐一进行说明:
一级结构的研究:
一级结构是指蛋白质分子内以共价键方式组成的结构。严格的说,一级结构不仅要测定氨基酸残基的序列,还要对与蛋白质相连的其他组分的成分和连接方式进行测定,但是目前一级结构的测定主要是对氨基酸残基的序列的分析。主要原因有二,一者绝大多数氨基酸是有蛋白质组成,二者各种与蛋白质复合的非氨基酸成分结种类繁多差异很大,具体的研究方法要看具体的结构,至少目前来说没有统一的研究方法。以下内容也主要是阐述氨基酸组分的具体情况。
A:氨基酸残基序列测定的方法:
目前通行的方法有三种:化学法,此法使用最早,其准确性已经在多年的试验中得到了验证,是公认的最为经典的方法;生物学法,是目前最常用的方法,即先确定编码氨基酸的DNA碱基序列,然后再由DNA碱基序列推出肽段的氨基酸残基的序列;物理方法:有X射晶体线衍射法,二维核磁共振和质谱分析。在进行分子质量较大的肽段的分析时,质谱需要和化学方法联合使用。下面就经典的化学测序法进行进一步说明。
B:化学测序法的具体策略:
尽管氨基酸序列千差万别,但其化学分析法大同小异,下面就对化学法策略和一些具体的方法进行说明:
a:首先要对待分析样进行分离提纯,目前主要是应用高效液相色谱和质谱联用进行分离纯化,当然还涉及分析化学的诸多工作不作做详细介绍。除此之外还要将各氨基酸链间的二硫键断裂,主要使用盐酸胍尿素和β-巯基乙醇处理,然后再将生成的巯基保护起来防止其被再次氧化。
b:制作氨基酸残基的小片段,制成小片段有利于后续的缝隙,这里就会用到一些专一性很强,而且高效的酶将其断裂(一些常见酶和其剪切位点见王克夷蛋白质导论P56)。然后将剪切好的残片进行分离和纯化,主要借助电泳完成。
c:下面就是一级结构测定的核心工作,氨基酸残疾序列的测定。Sanger法和edman法是最经典和目前来讲应用最为广泛的方法,二者的机理相同只是后者可以进行连续测定,可以认为是Sanger法的改良。值得注意的是这组需要用两种不同的酶分别剪切肽段,并分别测定其氨基酸残基序列。
d:将侧好的氨基酸残基进行拼接。
e:除了细胞质蛋白外(细胞质是还原性的环境),几乎所有的蛋白质中都存在二硫键,目前使用最为广泛的二硫键测定方法是对角线电泳法。
f:这里补充一点肽段质谱指纹法的知识。不同的氨基酸残基序列存在特异性的差异,这犹如人的这问,关键的使我们可以通过液-质联用技术实现这些差异的检测和表征工作,这样我们在测定不同肽段的氨基酸序列以前先进行一次指纹识别,并在序列库与已知的片段进行比对,如果形同就可以省去一些测定步骤。这正是蛋白质组学研究的范畴,所以丰富这个序列库意义重大。
C:蛋白质氨基酸残基序列正确性的评估:
a:用异源细胞表达,然后测定表达出来的蛋白质活性,比对与实际测定的形似程度。
b:借助质谱测定分子质量,然后进行相对分子质量的验证。
二级结构的研究:
A:二级结构的定义:
蛋白质的二级结构指蛋白质本身多肽链的折叠和盘绕的方式。二级结构主要有α-螺旋β-折叠和β-转角。常见的有α-螺旋和β-折叠。二级结构是通过骨架上的羰基和酰***键之间形成的氢键维持的,氢键是稳定二级结构的主要作用力。
蛋白质在形成立体结构时,其多肽部分首先折叠成α-螺旋和β-折叠结构,并由此进一步可折叠形成球。此时,将α-螺旋和β-折叠型结构称为二级结构。在蛋白质以外,例如在tRNA有三叶草型结构,也可称之为二级结构。
B:二级结构测定的一些具体办法:
a:圆二***(CD):多聚氨基酸种类不同就会出现不同的圆二色谱,对聚合氨基酸进行圆二色谱分析,将结果带入相关的分析公式,这样就可以各种具体的而结构的单元的含量。这种方法虽然简便易行,但是其精确度欠佳