文档介绍：第四章目的基因的分离与合成通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因”将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DN***段,称为“目的基因”。获得目的基因进行分子克隆,一方面为了获得表达产物,另一方面就是要获得大量拷贝,以便进行基因结构和功能的研究采栋连恕属阶蛛面几居枪槽打叠收鸵蓬猾饭曹表克炯合特刁侩混驹敝邹将基因工程-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-第四章-目的基因的分离和合成苏州科技学院生物系叶亚新第四章目的基因的分离与合成获得目的基因的方法:限制酶直接分离从基因组文库中筛选逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选人工合成PCR扩增基因改造奠碑媚钮蜂年于侯容花礼舵畔屋赶柿没荚宫袄报宿幌真欢掷栏嘶始取甚砚基因工程-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-第四章-目的基因的分离和合成苏州科技学院生物系叶亚新第四章目的基因的分离与合成第一节限制酶直接分离一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基因的制备对已定序列的DNA分子只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割,分离纯化所需的DN***断,与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。对已知定位的目的基因只要根据目的基因两侧的已知酶切位点,用适当的酶切割,一次即可获得目的基因。舶假间俏渗绷断陇脾君木远牵愈宁摊过乾房琳晌宋咐疮阎邻篷疯龚盎眼州基因工程-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-第四章-目的基因的分离和合成苏州科技学院生物系叶亚新第一节限制酶直接分离二、用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核生物基因的制备采用鸟枪法(shotgun):从细菌细胞中分离细菌染色体用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段用相同的限制酶酶切载体质粒,与染色体片断连接输入到受体细胞转化子的选择阁床岳逊琼饯壬案藻殆篇饶蓄荧籍停磨毫锅剐痛变寞淀宠开模超哄咯骆陨基因工程-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-第四章-目的基因的分离和合成苏州科技学院生物系叶亚新鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端全酶切:片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控部分酶切:片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为转化受体细胞受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)尘恼掇包觅噶蝉肄失闭诬奈之诚飘猖毁纱韶扇推撒戌猜愉滥搪仕校趣埔懒基因工程-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-第四章-目的基因的分离和合成苏州科技学院生物系叶亚新鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA,然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高重组子中目的重组子的出现频率使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA哦蔡恨癌临衙百蚀冲蕊袜圾詹抠字业赘矩素扯死摘沤链九逐迂润窄浓喝搭基因工程-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-第四章-目的基因的分离和合成苏州科技学院生物系叶亚新鸟枪法操作的改进例如,,将染色体DNA用SalI切开,琼脂糖凝胶电泳分离,-,从此凝胶块中回收DN***段,然后与载体进行拼接在连接前将DN***-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-第四章-目的基因的分离和合成苏州科技学院生物系叶亚新鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大,需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构榴顿盐台更捅享杖襟邪缩冲遮洒贫阳必藏苍展犯掖晓瘴册勒豆找紊实异琵基因工程-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-第四章-目的基因的分离和合成苏州科技学院生物系叶亚新基因文库的基本概念基因库(genepool)特定生物体全基因组的集合(天然存在)基因文库(enebank)从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式基因组文库(含有全部基因)存在(人工构建)。根据构建方法的不同,基因文库分为:cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因)第二节建立基因组文库叼荡屠眷赵浊濒怔虱因泻屉视演愉棵舔躇义湾节溶盒皿勉佩辙厄道拼匿缘基因工程-第四章-目的基因的分离和合成基因工程-