文档介绍：酶联免疫吸附实验 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) -乙肝两对半测定
张君龙严琳
临床免疫实验室
2016年4月5日
主要内容
ELISA技术的实验原理
ELISA技术的基本类型
ELISA技术的操作流程
乙肝病毒血清标志物
乙肝两对半检测的临床意义
酶免疫技术
抗原抗体反应特异性
酶高效催化反应的专一性
酶免疫测定
均相
酶免疫组化
酶免疫技术
异相
固相
液相
(定位,定性)
(定性,定量)
(ELISA)
ELISA实验原理
将抗体(或抗原)结合到固相载体表面,当加入标本后,相应待测抗原(或抗体)结合到固相抗体(或抗原)上,利用酶标记抗体(或抗原)和相应底物,通过洗涤、显色,测定有色产物的含量,即可检测出标本中待测抗原(或抗体)。
ELISA技术基本类型
间接法(检测抗体)
夹心法(检测大分子抗原;抗体)
竞争法(检测小分子半抗原;HBcAb, HBeAb)
捕获法(检测某抗体亚型成分,IgM测定)
产物颜色深浅和含量成正比
产物颜色深浅和含量成反比
乙肝病毒血清标志物检测原理
血清学标志
原理
包被试剂
标记或结合物
结果判断
HBsAg
夹心法
HBsAb
HBsAb
显色(+)
HBsAb
夹心法
HBsAg
HBsAg
显色(+)
HBeAg
夹心法
HBeAb
HBeAb
显色(+)
HBeAb
竞争法
HBeAb
HBeAb及中和抗原
不显色(+)
HBcAb
竞争法
HBcAg
HBcAb
不显色(+)
HBcAb-IgM
捕获法
抗人IgM μ链
HBcAg及HBcAb
显色(+)
ELISA操作流程图
准备工作(试剂平衡,洗液配制,编号)
加样
加酶
洗涤
显色
终止反应
观察结果
两步法需要
温育洗涤
温育
操作步骤
平衡:将试剂盒各组分从盒中取出,平衡
至室温(18-25℃)。
配洗液:充分摇匀浓缩洗涤液,用蒸馏
水按1:19稀释。(已配制)
编号:将微孔条固定于支架,按序编号。
操作步骤
加样:分别用加样枪在孔中加入待测血清样本50ul,阴、阳性对照50ul(1滴),空白不加。
加酶:分别在每孔中加入酶标记抗体50ul (1滴),空白不加,轻拍混匀。
温育:贴好密封膜,置37℃温育30分钟。
操作步骤
洗涤:用洗涤液充分洗涤6次,洗涤完后扣干
(每次洗涤保持30-60秒的浸泡时间)。
显色:每孔加底物和显色剂各50ul(1滴),轻拍混匀,置37℃反应10分钟。
终止:每孔加终止液50ul(1滴),混匀。
观察结果:酶标仪或者肉眼判读。