文档介绍：差异显示
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荧光差异显示系统
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主要内容
一、差异显示的基本原理
二、差异显示方法的建立及条件优化
三、差异显示的主要步骤
四、差异显示的优点和缺点
五、差异显示技术的改进
六、基因差异在表达中的应用
七、差异显示技术的展望
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一、差异显示的基本原理
简述:是利用一系列的oligo(dT)引物,逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA,通过PCR扩增的方法,转换成cDNA双链,再利用变性聚丙烯酰***凝胶电泳,将有差异的片段分开,筛选出目的基因。
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只要有足够的引物,那么任意细胞里的任意一个mRNA 分子都可以被探测到。而mRNA 差异显示技术和RAP-PCR 技术根本的区别在于其实行mRNA 逆转录时所采用的方法不同:在RAP-PCR中采用的只是随机的寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物,而mRNA 差异显示技术则是根据成熟的mRNA 3′端具有80~200 bp 的起保护作用的poly(A)尾这一特性,以一系列oligo(dT)12MN(N 代表A、C、T、G 4 种碱基中的一种,M 为A、C、G)引物中的一种锚定于一个亚群的mRNA 上,来获得cDNA。
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同时,PCR 反应、聚丙烯酰***凝胶电泳和测序等分子生物学的基本技术也被结合到了差异显示技术中来。mRNA 差异显示技术过程用一种oligo(dT)12MN 的引物逆转录真核细胞中表达的mRNA,可获得1/12 的cDNA,同时设计5′端一组随机引物,通过PCR 扩增,进行聚丙烯酰***凝胶电泳比较。最后将有差异的基因片段从凝胶上切割下来,用相同的锚定引物和随机引物对分离的片段进行二次扩增,得到差异片段后将该片段克隆、鉴定分析、测序,并同基因库的序列进行同源性比较或者将差异显示的DNA 克隆测序后作为探针,进行斑点杂交和反向Northern 印迹杂交,确定是否是真阳性结果,以进一步分析其功能。
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基因的差异性表达不仅是细胞形态和功能多
样性的根本原因,而且也是各种生理、病理及损伤过程的物质基础。因此,分离、鉴定差异表达的基因具有重要的意义。真核生物基因组中,仅约有10 %- 15 %的基因在细胞中表达,而且不同发育阶段、不同理状态和不同类型的细胞中表达的基因也不尽相同。
二、差异显示方法的建立及条件优化
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mRNA 差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法,其通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞的mRNA
进行分组逆转录及PCR 扩增,在相邻泳道上显示扩增结果,通过比较电泳图谱找出差异,对各种不同类型、不同分化时期以及异常细胞差异表达基因进行分离和比较,具有简单、快速、灵敏、重复性好的特点。研究引物的改进、退火温度变化与扩增产物特异性之间的关系,将有助于发现新的特异性基因的表达。
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三、差异显示的主要步骤
(1)提取总RNA 不能有DNA污染,一般用无RNA酶的DNA酶处理
(2)在逆转录酶作用下以Oligo T11MN 为引物,(M为G、A、C中的任一种,N为A、C、G、T任一种),进行逆转录;
(3)PCR反应扩增cDNA的第一条链;
(4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰***凝胶电泳使差异表达的cDN***段在6%测序胶上分开;
。
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(5)找出不同处理间差异显示的条带从胶上切割下来,并回收;
(6)克隆差异片差异片段可作为探针;
(7)Northern 杂交验证目的片段,去掉假阳性片段;
(8)对目的片段进行测序;
(9)以克隆的目的片段为探针从基因组文库中筛选出相应的全长基因
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