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农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
2013, 21(4): 489~497
DOI: .1674-
技术改进
Updated Technology
百合三种主要病毒的RT-PCR检测及脱毒技术研究
陈进李晓昕袁雪易瑾罗弦赵阳义鸣放*
中国农业大学观赏园艺与园林系,北京 100193
*通讯作者,******@cau.
摘要百合病毒病是影响百合切花和种球产量与质量的关键问题之一,虽然在我国百合病毒检测和脱
毒技术的研究已经展开,但是在病毒检测中存在着检测病毒的种类较单一和检测结果出现假阴性等问
题;脱毒方面也存在操作难度大、脱毒率不高等缺陷。本研究以麝香百合杂种系品种雷山一号(Lilium
longiflorum cv. Raizan 1)组培苗为试材,对侵染百合的 3 种主要病毒:黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,
CMV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus, LSV)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)的多重 RT-PCR
检测及病毒脱除技术进行了研究。根据百合 18S rRNA 和 3 种病毒的基因序列,设计了 4 对特异引物,并
对多重 RT-PCR 中的 dNTPs 浓度、Mg2+浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、退火温度和反应循环数等因素进行了
μ
筛选和优化。结果表明,进行多重 RT-PCR 的最佳反应体系为:dNTPs( mmol/L) L,Mg2+(25 mmol/
μμμμ
L) L,Buffer L,cDNA 1 L,CMV、LMoV、LSV、18S 上、下游引物各 L,Taq DNA 聚合酶
μμ℃℃℃℃
L,加 H O 补足至 25 L。最佳反应程序为:94 预变性 5 min;94 变性 30 s, 退火 30 s,72 延
2 ℃℃
伸 30 s,30 个循环;72 延伸 10 min,4 终止反应。由此建立了以百合 18S rRNA 为内参照,同时检测
CMV、LSV 和 LMoV 的多重 RT-PCR 技术。黑暗、变温热处理结合试管鳞茎培养只对脱除百合植株 CMV
≤
有效,脱毒率达 90%以上;黑暗、变温热处理后,切取 1 mm 的茎尖进行光培养能够有效脱除 CMV、LSV
和 LMoV 3 种病毒,脱毒率达到 %。此脱毒方法具有操作简便、培养周期较短、脱毒率高等优点,可以
为百合脱毒苗的生产提供指导。
关键词百合,多重RT-PCR,病毒检测,脱毒
Study on Molecular Detection and Elimination of Three Lily(Lilium
longiflorum) Viruses
CHEN Jin LI Xiao-Xin YUAN Xue YI Jin LUO Xian ZHAO Yang YI Ming-Fang*
Department of Ornamental Horticulture and