文档介绍：实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)完全手册
方法简介
所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检
测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光
化学物质,随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的
变化,从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR 是由三个步骤组成:
:依赖反转录酶将 RNA 反转录成 cDNDA;
2. 扩增:用 PCR 的方法扩增 cDNA;
:实时检测和定量扩增的产物.
RT-qRCR 影响分析可靠性关键点(Key porint):
、质量以及合理的检测方法设计

,如果不合理的分析,从分析结果中会得到混淆的错误结果,因此
通过对 RT-qPCR 的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性,最大化可重复性,而且还
需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分
析相适应的。
存在的问题
由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程,必然导致大家使用不同定量的来源物以
及数据分析:
、冰冻、甲醛固定的样品
,显微切割样本,单个细胞,组培细胞
RNA 或者 mRNA
反转录成 cDNA 的不同的引发策略

、灵敏度
7. 多类型的检测化学方法,反应的条件,热循环仪的分析以及汇报方式。
,内参的使用,归一化的方法,质量控
制等等因素严重影响 RT-qPCR 的可信度,重复性。
RNA 质量评价
现在 RNA 定量的程序很多。最近 EMBO qPCR course (
/conf_28) 比较了用 Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nan
odrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样
的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此,我们需要用统一套定量分析方
法来完成所有 RNA 样品的评价。
RNA 质量
RNA 质量主要包括 RNA 的纯度(没有蛋白质和 DNA 的污染)以及完整性。传统的 RNA
质量的评价通过分析 A260/A280 的比值或者对琼脂糖凝胶电泳 rRNA 的条带的分析。Agil
ent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent
的 2100 也是一种十分好的分析 RNA 质量的方法,它通过分析 18S 以及 28S rRNA 的分析
图谱,通过图谱来反应 RNA 的量和完整性,其完整性通过完整性系数(RIN)来反应。样
品的 RINs 在 10-4 之间。10 代表完整的 RNA,4 代表没有完整的 rRNA 带。