文档介绍：禽流感病毒 RT-PCR 试验方法

禽流感病毒 RT-PCR 试验方法(一)
1 范围
本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒 H5、H7、H9 血凝素亚型及
N1、N2 神经氨酸酶亚型的 RT-PCR 鉴别技术。
本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款,凡是注日期的引用文件,其
随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标
准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件,其最
新版本适用于本标准。
GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术
3 实验室条件
仪器:PCR 仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外
凝胶成像仪、微量移液器、水浴箱等。
从事 RT-PCR 工作的实验室尽可能分区,根据条件划分出 RNA 提取区、基因扩增区、
电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理,避免对实验室造成污染。
注意个人防护和环境保护,电泳中用到的 EB 可诱发基因突变,试验中被 EB 污染的物
品要有专用收集处,并通过焚烧作无害化处理。
4 试剂的准备
试剂
变性液:见附录。
2M 醋酸钠溶液():见附录。
水饱和酚(pH )。
氯仿/异戊醇混合液:见附录。
M-MLV 反转录酶(200u/μL)。
RNA 酶抑制剂(40u/μL)。
Taq DNA 聚合酶(5u/μL)。
% 琼脂糖凝胶:见附录。
1
50×TAE 缓冲液:见附录。
溴化乙锭(10 μg/μL):见附录。
加样缓冲液:见附录。
焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水:见附录。
5×反转录反应缓冲液(附录 )。
dNTPs(附录 )。
10×PCR Buffer(附录 )。
DNA 分子量标准。
引物:见附录 B。
5 操作程序
样品的采集和处理:按照 GB/T 18936 中提供方法进行。
RNA 的提取
设立阳性、阴性样品对照。
异硫氰酸胍一步法
将组织或细胞中加入适量的变性液,匀浆。
将混合物移至一管中,按每毫升变性液中立即加入乙酸钠,1mL 酚,
氯仿-异戊醇。加入每种组分后,盖上管盖,倒置混匀。
将匀浆剧烈振荡 10sec。冰浴 15min 使核蛋白质复合体彻底裂解。
12 000 rpm,4℃离心 20min,将上层含 RNA 的水相移入一新管中。为了降低被处
于水相和有机相分界处的 DNA 污染的可能性,不要吸取水相的最下层。
加入等体积的异丙醇,充