文档介绍：“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳”实验教学尝试
杜伟(江苏省邳州市第二中学 221300)
摘要:学生不受传统实验的限制,在教师的指导下查资料、设计实验步骤、选择实验器材进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验,得到了清晰的电泳图谱。
关键词: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、开放性实验、电泳图谱
蛋白质电泳作为分子生物学研究的基本技术出现在人教版高中生物选修1中(选做),但由于实验条件和技术的限制,许多中学无法开设此实验。为了培养学生实验动手能力,让他们更好的理解蛋白质电泳的知识,充分体会参与科研实验的乐趣,为以后的科学研究打下坚实的基础,并为其他学校开设该实验提供借鉴。我们对SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验进行了认真的研究,指导生物兴趣小组同学进行开放性实验。
1 实验准备
(1)实验材料:低分子量蛋白质标准,购自宝生物工程(大连)有限公司。
(2)学生在教师的指导下查资料、设计实验步骤、选择实验器材。
2 实验过程
(1) 溶液与缓冲液的配制
学生查阅资料,寻找①30%丙烯酰胺单体贮液;②分离胶缓冲液贮液( Tris-HCl,)、浓缩胶缓冲液贮液( Tris-HCl,);③10%SDS、10%过硫酸铵、电泳缓冲液、染色液、脱色液配置方法。在教师指导下,完成上述缓冲液配制。
(2) SDS-PAGE电泳
学生在教师的指导下完成以下实验过程:
步骤
学生活动
教师指导
1
玻璃板洗净,晾干后小心加入封条,装在垂直电泳槽上,将玻璃板固定好。
固定玻璃板时两面用力要均匀,防止夹坏玻璃板,同时应夹紧,防止漏水。
2
制作12%分离胶:在专用烧杯中加入30% mL; mL; Tris-HCl() mL;10%SDS100
迅速加到烧杯后,摇匀。
μL;10%过硫酸铵100μL;TEMED4μL。
3
分离胶混匀后快速用移液器移入玻璃板夹层中,。
不要出现气泡,若出现,立即用微量注射器吸出。
4
小心地在分离胶表面加一层水,封住胶面,使凝胶表面平直,凝胶在室温下放置大约40分钟。
用移液器沿着玻璃板上方从左向右轻轻加双蒸水,至加满玻璃板夹层。
5
制作5%浓缩胶:专用烧杯中加入30% mL; mL; Tris-HCl() mL;10%SDS80μL;10%过硫酸铵80μL;TEMED8μL。
迅速加到烧杯后,摇匀。
6
倒掉玻璃板夹层中的水,用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶,用移液器灌注浓缩胶至灌满玻璃板为止。
同第3步。
7
迅速插入与模具大小相同,与凝胶厚度相当的梳子。
梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
8
浓缩胶凝固后(约40分钟),拔掉梳子,向胶槽中倒入电泳缓冲液,用微量注射器冲洗加样孔。
指导学生正确处理实验废弃物。
9
点样,每孔上样体积为10µL。
教师演示操作过程。
10
电泳: 90 V电压进行电泳,当溴酚蓝前沿到达浓缩胶和分离胶交界处时改用120V电压,至溴酚蓝前沿到达分离胶底部时停止电泳。
引导学生思考;为什么在电泳过程中要换电压?
11
染色:电泳结束后,将