文档介绍：PCR扩增DNA特异性片段实验方法与步骤
一、实验目的
本实验目的了解PCR反应用来扩增DNA 特异性片段实验的的基本原理、实验方法和操作步骤,熟练掌握PCR反应基本体系配制和实验条件的设定。
二、实验原理
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域,它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析,还可用于突变体和重组体的构建,基因表达调控的研究,基因多态性的分析,遗传病和传染病诊断,肿瘤机制探查,法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命,它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。
PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法,由高温变性,低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环,然后反复进行,使目的的DNA 得以迅速扩增,主要过程如图6。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板;人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合;DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3"端开始掺入,沿模板5"—3"方向延伸,合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,所以PCR 产物以指数方式增加,经25—30次周期之后,理论上可增加109倍,实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点,但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5"—3"核酶外切酶活性,不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入,估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误,不过Innis M·A 发现,错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向,使得错误不会扩大。
PCR 技术应用广泛,不可能有这样一套条件满足所有的实验,但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应,即使有的不适应,至少也确定了一个共同的起点,在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意,以求取得满意结果。
1、模板:单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品,若起始材料是RNA,须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品,但为了保证反应的特异性,一般宜用ng 量级的克隆DNA,ug 级的染色体DNA,待扩增样品质量要求较低,但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶,Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。
2、引物:引物是决定PCR 结果的关键,下列原则有助于引物的合理设计。(1)尽可能选择碱基随机分布,GC 含量类似于被扩增片段的引物,尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。(2 )避免具有明显二级结构(尤其是在引物3"—末端)的序列。
(3 )防止引物间的互补,特别要注意避免具有3"末端重叠的序列。
(4)引物的长度约为20个碱基,较长引物较好,但成本增加,短引物则特异性降低。
(5)引物浓度不宜偏高,过高易形成二聚体,而且扩增微量靶目标或起始材料是粗制品,容易产生非特异产物。
3、缓冲液:PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果,特别是MgCl2,其浓度对专一性和扩增量有重大影响,(每种dNTP ),浓度过高,使反