文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
检测细菌内***的酶联免疫吸附法及免疫传感器法的研究
姓名:周卓晟
申请学位级别:硕士
专业:卫生检验与检疫
指导教师:黄正
2010-12
华中科技大学硕士学位论文
检测细菌内***的酶联免疫吸附法及免疫传感器法的研究
硕士研究生:周卓晟
导师:黄正副教授
摘要
细菌内***广泛存在于空气、土壤和水等环境介质当中,与人体健康密切相关,
一定剂量的内***在人体免疫功能低下或有创面情况入侵后,机体本身不会刺激足够
的体液免疫来使***失效,极微量(1-5ng/公斤体重)的内***就能导致机体体温升
高,而后引起的有害症状通常包括:致热反应、白细胞数目减少、Shwartzman 反应、
全身炎症反应综合症(SIRS)、内***血症和低血压、多脏器功能衰竭综合症(MODS)
等。
目前,用于细菌内***的检测方法有:家兔热原试验法、鲎实验法、酶联免疫测
定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和生物传感器等。家兔热原试验法
由于不能定量、耗时和敏感度不高等缺点有被逐渐淘汰的趋势。鲎试验法是目前内毒
素检测的金标准,已被广泛的应用于临床和环境中的内***检测,具有快速、简便、
灵敏度高()、易推广标准化等优点。但是一些本身带有颜色及浊度较高的
样品会影响检测结果,同时鲎试剂的制备需要捕杀大量稀有动物鲎,因此,寻找鲎试
剂的替代方法成为研究的重点。ELISA 由于兼有抗体的高特异性和酶的放大作用而被
应用于内***的检测,能免于样品颜色的干扰。缺点在于检测精度较鲎试验法低,故
在实际检测中应用较少。传感器的特点在于其物理元件测量速度快、灵敏度高等,能
将微小环境的变化转化为可测的光电信号,与具有生物活性物质联合检测内***是目
前传感器研究的方向。
本文通过制备出抗内***的兔多克隆抗体血清,将多粘菌素 B(Polymyxin B,
PMB)与抗体联合建立夹心 ELISA(Sandwich ELISA, sELISA)法检测内***,并进
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一步研制出基于 PMB 吸附作用的免疫传感器。
第一部分大肠杆菌内***多克隆抗体的制备及其在间接竞争
性 ELISA 中的应用
目的:制备大肠杆菌内***的兔多克隆抗体;探讨ELISA法检测大肠杆菌精制内***
的灵敏度;并研究其与细菌复合型内***的反应。方法:将大肠杆菌精制内***作为
免疫抗原免疫家兔,并每周于兔耳缘取少量血制备血清测其效价,第五次免疫一周后
心脏取血;将一定量的精制内***包被于96孔板中,再同时加入定量的抗内***的兔
多克隆抗体和不同浓度的内***,建立用于检测内***的间接竞争性
ELISA(petitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA),并优化包被
用大肠杆菌精制内***抗原和检测用兔多抗的最佳使用浓度;同时比较兔多抗与羊多
抗对精致型内***和复合型内***的反应效果。结果:随着逐次提高免疫剂量免疫家
兔后,抗内***血清的效价逐渐提高,在第五次免疫后OPD底物显色效价达到1:6400
(TMB底物显色为1:16000);在包被抗原浓度为100μg/mL和兔多抗使用稀释比为1:500
的最佳使用条件下建立检测精制内***的icELISA,结果显示:内***检测范围在
~100μg/mL内,,线性范围回归方程为:y = - ln(x)
+ ,,最低检测限为100ng/mL;兔多克隆抗体与羊多克隆抗
体均能与大肠杆菌O157:H7菌液内的复合型内***发生反应,反应效价分别为1:16000
与1:32000。结论:成功制备出内***兔抗多克隆抗体,其效价与国内同类抗体效价相
当,与国外商品化的羊多克隆抗体相比较,能与精致型、复合型内***(游离型类毒
素和细胞结合型内***)反应,实用性更为广。
第二部分多粘菌素 B 与抗体联用的 sELISA 法检测内***
目的:建立多粘菌素 B(Polymyxin B, PMB)与抗内***兔多克隆抗体联合的
PMB-ET-pAB sELISA 用于内***的检测。方法:将一定浓度的多粘菌素 B 包被于 96
孔板中,封闭后逐次加入不同浓度的内***、固定稀释度的内***抗血清和酶标抗体,
II
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显色后于酶标仪 A492nm 处检测 值;并与使用多克隆抗体建立检测内***的
icELISA 相比较。结果:PMB-ET-pAB sELISA