酶联免疫检测实验的原理和技术要点.pdf

文档介绍：酶联免疫检测实验的原理和技术要点
一、基本原理
1971 年 Engvall 和 Perlmann 发表了酶联免疫吸附剂测定
(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)用于 IgG 定量测定的文章,使得 1966
年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方
法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。②
使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活
性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原
或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体
上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受
检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物
的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分
析。由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高
的敏感度。
二、主要的检测模式
ELISA 可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有 3 种必要的试
剂:①固相的抗原或抗体,②酶标记的抗原或抗体,③酶作用的底物。根据试剂的来
源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。
(一)双抗体夹心法
双抗体夹心法(图 15-4)是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

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图 15-4 双抗体夹心法测抗原示意图
(1)将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质。
(2)加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗
体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
(3)加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗
体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
(4)加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗
原的定性或定量。
根据同样原理,将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物,即可用双抗原夹心法测
定标本中的抗体。
(二)双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别
作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步(图
15-5)。这种双位点一步不但简化了操作,缩短了反应时间,如应用高亲和力的单克隆抗体,测
定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELISA 提高到新水平。

图 15-5 双位点一步法示意图
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在一步法测定中,应注意钩状效应(hookeffect),类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。
当标本中待测抗原浓度相当高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成夹心复
合物,所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
(三)间接法测抗体
间接法(图 15-6)是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相
结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:
(1)将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原:洗涤除去未结合的抗原及杂质。
(2)加稀释的受检血清:其中的特异抗体与抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤
后,固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,
在洗涤过程中被洗去。
(3)加酶标抗抗体:与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后,
固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体,可用酶标羊抗人 IgG
抗体。
(4)加底物显色:颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原,可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

图 15-6 间接法测抗体示意图
(四)竞争法
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竞争法(图 15-7)可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标
抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下:
(1)将特异抗体