文档介绍：华中科技大学博士学位论文
摘要*
随着水体富营养化加剧,藻类所引起的水污染问题己越来越引起人们的关注,
蓝藻是目前已知产生毒素最多、对人类健康造成的危害最大的藻类。微囊藻毒素-LR
(microcystins-LR,MC-LR)是有毒蓝藻细胞合成的二级代谢产物,是一种细胞内
毒素。微囊藻毒素可影响鱼类的胚胎发育和生长,也可引起肝脏、肾脏等内部器官
的病理变化,和导致鱼体的氧化损伤等。然而,有关微囊藻毒素对鱼类分子水平上
的毒性效应的研究则很少。本研究以斑马鱼和鳙鱼为对象,采用实时荧光定量 PCR、
分子克隆和免疫印迹技术在分子水平上揭示了 MC-LR 对鱼类的毒理效应。
本研究中采用人工繁殖的方法收集健康的斑马鱼胚胎,待孵化出膜后,用浓度
为 200μg/L 和 800μg/L MC-LR 溶液浸泡幼鱼进行攻毒实验。在染毒 12h,24h,48h,
96h 和 168h 后取样。用实时荧光定量 PCR 方法检测了斑马鱼幼鱼的重组激活基因
Rag(Rag1,Rag2)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、T 细胞受体α(TCRα)、
转录因子 GATA1、锌指纹蛋白(Ikaros)和热休克蛋白基因(HSP90、HSP70、HSP60、
HSP27)的表达变化。发现 Rag1、 Rag2、 LCK、 TCRα、GATA1 和 Ikaros 都有
表达上升趋势,特别是在 800μg/L MC-LR 处理后,在很多时间点内表达上升明显,
与对照组有显著差异(P<);热休克蛋白基因(HSP90、HSP70、HSP60、HSP27)
的表达变化更为明显,在 200μg/L 和 800μg/L MC-LR 处理后,所有热休克蛋白基因
的表达均有上升,且差异明显(P<),尤其是 HSP70 在 800μg/L MC-LR 处理 168h
后,其表达量上升了近 300 倍。这说明 MC-LR 可影响斑马鱼幼鱼早期发育的重要调
控因子、转录因子和热休克蛋白的表达,从而推测 MC-LR 可能影响斑马鱼的早期发
育和免疫系统功能。
本研究通过分子克隆技术中的 RACE 方法获得了两个鳙鱼去毒酶相关基因的
cDNA 全长,并进行了系统进化分析及推导的蛋白质序列分析。
谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GPX)基因 cDNA 全长 903 个核苷酸
(nucleotides, nt)(GenBank accession no. FJ357422),包含 426 nt 的开放阅读框,编
码 142 个氨基酸,其中 5′、3′端非编码区分别为 182 nt 和 292 nt,推测 GPX 蛋白的
分子式 C740H1144N196O213S4,分子量为千道尔顿,等电点 ,预测该蛋白
为水溶性。系统进化分析和氨基酸序列比对的结果表明,鳙鱼 GPX 与草鱼、鲢鱼、
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鲋鱼的相似性较高,分别为 %,%,%。
谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR) 基因 cDNA 全长 831 个核苷酸
(nucleotides, nt)(GenBank accession no. FJ349627),包含 717 nt 的开放阅读框,编
码 239 个氨基酸,其 5′、3′端非编码区分别为 74 nt 和 40 nt,推测 GR 蛋白的分子式
C1131H1796N324O347S7,分子量为千道尔顿,等电点 ,预测该蛋白为水溶性。
系统进化分析和氨基酸序列比对的结果表明,鳙鱼 GR 与斑马鱼、大西洋鲑相似性
较高,分别为 %和 %。
在健康鳙鱼中,对两个基因转录和表达产物的器官组织分布进行了详细的分析。
实时荧光定量 PCR 的结果表明,GPX 和 GR 在所有被检测的鳙鱼组织中都有表达,
呈组成型表达,且具有相似的组织分布模式,即在肝脏中的表达最高,其次是脾脏、
鳃、中肾、头肾等,脑和心脏中的表达较低。分别构建 GPX 和 GR 基因的原核表达
质粒 pQE40-GPX 和 pQE40-GR,通过原核表达、表达蛋白纯化、并制备多克隆抗体,
对脑、鳃、心脏、头肾、中肾、肝脏、肌肉、脾脏、和胸腺等器官中的目的基因蛋
白进行免疫印迹分析。免疫印迹 Western blotting 结果显示 GPX 蛋白在各个组织中广
泛表达。
经腹腔注射 MC-LR(50μg/kg body weight)对鳙鱼进行染毒实验,以注射灭菌
生理盐水作为对照,分别于染毒后 6h,12h,24h