文档介绍：狂犬病病毒HEP-Flury-mEG株的拯救与鉴定
郑学星1,2,杨松涛1,2*,王化磊1,2,薛向红1,2,盖微微1,2,赵永坤1,2,郭霄峰2,夏咸柱1,2*
(1. 军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春 130062;2吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春 130062;3华南农业大学兽医学院,广东广州 510642)
【摘要】目的家养动物是人狂犬病的重要传染源,研制一种新型的安全,廉价的动物狂犬病疫苗对狂犬病的防控很有必要。方法将ERA株G蛋白333位毒力位点修饰为谷氨酸后替换至HEP-Flury株基因组。重组感染性克隆质粒和四个辅助蛋白表达质粒共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒。结果通过荧光抗体染色,RT-PCR检测及电镜观察,证明获得了重组狂犬病毒HEP-Flury-mEG株。该病毒滴度高,形态完整,传代稳定。结论为进一步研究狂犬病毒病毒的生物学特性和新型基因工程疫苗奠定了基础。
【关键词】狂犬病病毒;HEP-Flury株;ERA株;反向遗传;糖蛋白
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒引起中枢神经系统感染的自然疫源性人畜共患传染病,并且仍是当前严重的公共卫生问题,全世界每年因狂犬病导致死亡的人数为5~6万。我国属于狂犬病高发区,在过去的59年里,约有119,996人死于狂犬病,犬依然是主要的传染源[1-2]。疫苗接种是减少发病和死亡的最重要的应对措施,WHO建议,动物群体的狂犬病有效免疫率超过70%,即可控制动物狂犬病的发生和流行。因此研制安全,高效,廉价的动物疫苗是解决狂犬病问题的关键[3]。
狂犬病病毒(Rabies virus)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)。RV基因组为单股负链不分节段的RNA,长度为11,928或11,932 nt。基因组从3’端至5’端的排列依次为N,P,M,G和L基因,分别编码核蛋白(N),磷酸化蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和RNA多聚酶(L)五个主要结构蛋白[2]。G蛋白位于病毒颗粒表面,与狂犬病病毒的致病性相关,是病毒嗜神经病原性的决定结构,也是结合细胞受体的决定性结构。G蛋白是狂犬病毒唯一能够持续诱导产生病毒中和抗体的抗原,不同毒株G蛋白的免疫效果有所不同[4-5]。
本教研室在前期的研究中,建立了HEP-Flury株的反向遗传操作技术平台,在此基础上,进行不同毒株间G蛋白置换,期望获得免疫原性好、毒力弱,生长滴度高的重组狂犬病毒疫苗株
[6]。
材料与方法
1 病毒株、质粒、菌株和细胞株
ERA株狂犬病毒为本实验室保存;pHEP-N,pHEP-P, pHEP-L,pHEP-G载体(分别含有狂犬病毒N、P、L、G基因ORF)为本实验室构建;pHEP-(包含HEP-Flury株全基因组);BHK-21细胞、NA细胞为本实验室保存;
2 试剂和仪器
PrimeSTAR DNA聚合酶、pMD18-T simple载体购自TAKARA公司;AflⅡ、PstI内切酶、T4 连接酶购自NEB公司;Superfect转染试剂、RNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Qiagen公司;DMEM,胎牛血清,双抗购自GIBCO 公司;荧光素标记抗狂犬病毒N蛋白抗体为本室制备。
3 重组全长感染性cDNA的构