文档介绍：核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中,核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。(1)紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。因此,可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA,单链DNA浓度约为33µg/ml,RNA约为40μg/ml,寡核苷酸约为35μg/ml。如用1cm光径,用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:DNA(mg/ml)=50×OD260读数×稀释倍数/1000RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数/1000。A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/,。假如比值低,表示受到蛋白(芳香族)或分类物质的污染,需要纯化样品。比值=%蛋白质/DNA溶液。A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和RNA的A260/。(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度,。假如不足,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。实验步骤1、,10mmo1/L的Tris缓冲液,内含(1mmol/LEDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。2、用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线,测定OD260和OD280,并计算比值:OD260/OD280,~。。3、根据每毫升1微克的纯DNA的OD260值=,计算所得DNA的纯度;每毫升1微克的纯RNA的OD260值=,计算所得RNA的纯度。~,否则不符合上述线性关系。A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考,但A260/A280比值会受pH影响。如果未调pH,比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值,建议在10mMTrisCl,,此时纯净的DNAA260/-(注意应使用同样缓冲液作为对照)。常见问题分析1、DNA浓度测定的OD260/,说明存在RNA,可重新用RNaseA处理,酚:***仿:异戊醇(23:24:1)抽提;DNA浓度测定的OD260/,则说明有蛋白质等杂质存在,需再用蛋白酶K、SDS及盼、***仿、异戊醇重新对DNA进行纯化(也可加入1/8体积的3MNaAc()与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。RNA浓度测定OD260/,说明溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显;OD260/OD280比