文档介绍：聚合酶链式反应,实验报告实验二聚合酶链式反应一、实验原理聚合酶链式反应是利用DN***段旁侧两个短的单链引物,在体外快速扩增特异DN***段的技术。它应用热稳定的聚合酶,通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环,DN***段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始,可产生ug量的PCR产物。二、器材与试剂 :移液器,EP管,热盖PCR仪,电泳仪,量筒,锥形瓶,微波炉,电子天平,紫外照色仪 :引物,模板,TaqDNA聚合酶,原料,缓冲液与Mg2+,H2O,2*PCRmix溶液,DNA染料三、实验步骤 PCR反应体系的建立取离心管,依次加入试剂混匀 *PCRmix15μl PCR仪的热循环反应把离心管放入PCR仪中,由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 :模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备; (复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至56℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; :经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次,每次需要2-3分钟。电泳检测结果扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中,电泳结束后,放到紫外照射仪中进行透射,电泳明胶显示清晰的条带,如下图所示加入的为1号样,出现在500bp左右条带,而预算结果为扩增出492bp条带,故实验成功。四、讨论 +离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 ,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。 :溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖中的DNA,可与DNA结合,用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。 :电泳指示剂,相当于300bp的DNA的电泳速度。 Ⅰ是由单独的PCR扩增产物混合而成,已含有1xLoadingBuffer,可以直接电泳。包括11条双链DN***断:100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp和1500bp。特异性加强500bp。每次上样4~5μL。 -1ug或102--105拷贝,浓度过高反而会抑制反应的进行。 ,常用—,浓度过高则特异性下降,会形成引物二聚体影响试验结果。五、结果及结论: 经电泳检测到PCR扩增产物中出现500bp左右条带,PCR扩增成功。实验三聚合酶链式反应以及琼脂糖凝胶电泳实验目的 ;; ;;。,依据DNA半保留复制的机理,在含有Mg2+的缓冲溶液中,采用耐热的DNA聚合酶在特异性引物的引导下,通过dNTP为原料,以cDNA或DNA等为模板,在人为控制DNA合成系统温度调节下,通过变性、退火及延伸等3个步骤的循环进行,在体外进行双链DNA变性为单链,单链DNA与特异性引物退火形成局部双链,进而在DNA聚合酶的作用下使引物沿相应模板延伸为特异性引物所限定范围的大量双链DNA的体外合成反应。本质为体外DNA合成的酶反应。,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。在一定电场强度下偏碱性的缓冲液中,DNA分子带负电,其迁移速度取决于分子筛效应,在电荷效应与分子筛效应作用下,具有不同的相对分子量及构型的DN***段泳动速度不同。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可以分离分子量相同,但构型不同的DNA分子。如质粒的三种构型的泳动速率不同:超螺旋闭合环状质粒最快,线型质粒其次,开环质粒最慢。实验步骤 PCR加样术式在一微量离心管中依次加入下列试剂:水煮裂解后的细菌