文档介绍：1 目的规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒(HBV-DNA)的检验工作,指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测,保证检验结果的质量。2 范围本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒(HBV-DNA)3 试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒4 仪器RocheLightCycler荧光PCR检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器(覆盖1-1000μl)5 样品处理样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理,具体操作见本规程附录1和附录2。6 ,再打开计算机电源。,按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。:程序循环温度保持时间11次93℃2分钟240次93℃5秒57℃45秒31次40℃,以免荧光物质泄漏污染仪器。,并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。,按仪器操作规程开始循环。,取出PCR反应管,密封放入垃圾桶。:反应结束后自动保存检测数据文件,调整荧光数值为F1/F2。点击Quantification读取结果。:取3~8个循环的荧光信号。(阈值):调节在阴性质控品以上,要求在Step3:Analysis下相关性r值<-,接近-。:保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值(默认为40)。(M),关闭计算机。=40,则实验样品的UUDNA含量(基因拷贝数/ml)<1×103。<40,则实验样品的UUDNA含量(基因拷贝数/ml)=,按实际结果报告;对可疑结果应复查,需要时与临床联系。8 。。9 《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》《临床基因扩增检验实验室工作规范》10 质量记录附录1:HBV项目标本采集、运送流程图医生填好申请单护士抽取清晨空腹静脉血2-3ml放至无菌的一次性无抗凝剂试管中,整个过程须注意勿溶血,管和验单均写上患者名字、盖好管盖。立即送检如延误,存放于-20℃冰箱保存,保存期为6个月实验室接收标本合格标本有疑问标本不合格咨询临床通知临床重采样,并登记标本合格标本不合格登记、接收注意手及其它外物勿接触到血或管、盖内壁标本运送用0℃冰壶附录2:HBV样本处理流程图将血清标本6,℃沸水浴10min10,000rpm离心5min4℃充分裂解6-8小时 转置反应管6,000rpm离心20秒取上清2ul点样阳性标准品(1×108基因拷贝/ml)6,000rmp离心数秒阳性标准品的稀释及处理:以下步骤同标本处理加40ul40ulDNA提取液分别吸取阳性标准梯度和阴性质控管各40ul以阴性质控品为稀释液将阳性标准品作107~104的倍比稀释充分混匀荧光探针定量PCR技术原理及应用      PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增,实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR(FQ-PCR)是一种新的基因定量检测技术,国外文献多用“实时定量PCR(realtimequantitativePCR)”或“TaqManPCR(以美国PE公司商标命名)”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交及光谱技术结合在一起,从而实现了对目的基因的准确定量检测,正发展成为临床实验诊断的常规技术。      FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性,在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交,探针的5’端标以荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素,荧光发射峰值在518mm处),靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四***诺丹明,荧光发射峰值在582nm处),两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时,5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制,不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在,就会扩增出特异核酸片段,荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸(复制)期,Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板