文档介绍：HBV-DNA PCR 检测规程文件编号: SZGL-C00 5 -00 版本:00 修订次数: 00 末次修(制) 订日期: 20030822 1 目的规范 LightCycler 荧光 PCR 检测仪检测乙型肝炎病毒( HBV-DNA )的检验工作,指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测,保证检验结果的质量。 2 范围本规程适用于 LightCycler 荧光 PCR 检测仪检测乙型肝炎病毒( HBV-DNA ) 3 试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV) 核酸扩增荧光检测试剂盒 4 仪器 Roche LightCycler 荧光 PCR 检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器(覆盖 1-1000 μl) 5 样品处理样品处理按《 PCR 实验室标本处理规程》进行收集和处理, 具体操作见本规程附录 1和附录 2。 6 测定 PCR 扩增打开稳压器电源,再打开计算机电源。打开扩增仪电源,按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。将循环条件设定为: 程序循环温度保持时间 11次 93℃2 分钟 2 40次 93℃5秒 57℃ 45秒 31次 40℃0秒检查反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污染仪器。将待反应的 PCR 反应管放入扩增仪中, 并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。 HBV-DNA PCR 检测规程文件编号: SZGL-C00 5 -00 版本:00 修订次数: 00 末次修(制) 订日期: 20030822 关闭扩增仪盖,按仪器操作规程开始循环。扩增结束后关闭扩增仪电源,取出 PCR 反应管,密封放入垃圾桶。产物分析条件设置:反应结束后自动保存检测数据文件,调整荧光数值为 F 1 /F 2 。点击 Quantification 读取结果。基线的确定:取 3~8 个循环的荧光信号。噪声容限(阈值):调节在阴性质控品以上,要求在 Step3 : Analysis 下相关性 r 值< - ,接近- 。对照标准:保证阴性质控品的 Ct 值不出现任何数值(默认为 40 )。最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值( M ),关闭计算机。 7 结果判断如果 Ct 值= 40 ,则实验样品的 UU DNA 含量(基因拷贝数/ml )< 1× 10 3。如果 Ct 值< 40 ,则实验样品的 UU DNA 含量(基因拷贝数/ml )= M 检测样本中核酸阳性时,按实际结果报告;对可疑结果应复查,需要时与临床联系。 8 注意事项各标本沸水浴时间误差不超过 1 分钟。加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。 9 支持性文件《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》《临床基因扩增检验实验室工作规范》 10 质量记录 HBV-DNA PCR 检测规程文件编号: SZGL-C00 5 -00 版本:00 修订次数: 00 末次修(制) 订日期: 20030822 附录 1: HBV 项目标本采集、运送流程图医生填好申请单护士抽取清晨空腹静脉血 2-3ml 放至无菌的一次性无抗凝剂试管中, 整个过程须注意勿溶血,管和验单均写上患者名字、盖好管盖。立即送检如延误,存放于-20 ℃冰箱保存,保存期为 6个月实验室接收标本合格标本有疑问标本不合格咨询临床通知临床重采样,并登记标本合格标本不合格登记、接收注意手及其它外物勿接触到血或管、盖内壁标本运送用 0℃冰壶 HBV-DNA PCR 检测规程文件编号: SZGL-C00 5 -00 版本:00 修订次数: 00 末次修(制) 订日期: 20030822 附录 2: HBV 样本处理流程图转置阳性标准品的稀释及处理: 充分混匀将血清标本 6,000 rpm. 离心 20s 吸取上层血清 40ul 加入 40 ul DNA 提取液充分振荡充分混匀 100 ℃沸水浴 10 min 4℃充分裂解 6-8 小时 10,000 rpm 离心 5 min 取上清 2 ul 点样反应管 6,000 rpm 离心 20秒插入圆形卡盘倒置 10秒上机扩增 6,000rmp 离心数秒阳性标准品(1× 10 8 基因拷贝/ml ) 以阴性质控品为稀释液将阳性标准品作 10 7~ 10 4 的倍比稀释分别吸取阳性标准梯度和阴性质控管各 40ul 以下步骤同标本处理加 40ul40 ul DNA 提取液 HBV-DNA PCR 检测规程文件编号: SZGL-C00 5 -00