文档介绍：分离纯化的意义:①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸,研究其结构与功能,对于了解生命活动的规律,阐明生命现象的本质有重大意义。
②工业生产的需要:食品、发酵、纺织、制革等工业,需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。
③医疗的需要:如用猪胰岛素治疗糖尿病。
④基因工程的需要
酶活力:指酶催化反应的能力
1min催化1μmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位(Unit),采用最适条件
酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢,即酶催化的反应速度越快,酶活力越高,反之则表示该酶活力低。
酶的总活力:指样品的全部酶活力总活力=酶活力×总体积(ml) 或=酶活力×总质量(g) 总活力=活力单位数/ml酶液×总体积(m1)
比活力:指酶纯度指标指单位蛋白质所含有的酶活力(Unit/mg蛋白)
比活力=活力单位数/mg蛋白(氮) =总活力单位数/总蛋白(氮)mg
回收率(百分产量):提纯后与提纯前酶的总活力之比回收率=每次总活力/第一次总活力×100% ;提纯倍数:提纯后与提纯前比活力之比提纯倍数=每次比活力/第一次比活力
基本原则:提取过程中避免酶变性而失去活性;防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等;
要求在低温下操作;加入的化学试剂不使酶变性;操作中加入缓冲溶液.
抽提有效成分的影响因子:1.   pH值2.   溶剂的极性和强度3.   水解酶4.   温度5.   搅拌6.   氧化 DTT PVP 7.   金属离子 1-3mmol/LEDTA8.   抽提液与抽提物的比例 5:1
预处理
细胞破碎: 机械法:匀浆、研磨、压榨、超声等;非机械法:渗透、酶溶、冻融、化学等
细胞破碎方法组织种类
匀浆大多数动、植物组织
超声细胞混悬液
研磨细菌、植物细胞
酶溶细菌、酵母
冻融裂解培养细胞
机械破碎
通过机械运动产生的剪切力,使组织、细胞破碎。
捣碎法研磨法匀浆法
物理破碎
通过各种物理因素的作用,使组织、细胞的外层结构破坏,而使细胞破碎。
温度差破碎法压力差破碎法
超声波破碎法
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎
有机溶剂:甲苯***丁醇***仿表面活性剂:Triton、Tween
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,使细胞外层结构受到破坏,而达到细胞破碎
自溶法外加酶制剂法
二、抽提(蛋白质溶解)抽提-通常是指用适当的溶剂和方法,使原料中有效成分分离出来的过程。
理想的抽提溶液应具备下述条件:
、价格低廉、操作安全
酶的提取工作应在获得材料后立即开始,否则应在低温下保存,-20 ℃- -70℃为宜。或将生物组织做成***粉保存。
水溶法:大部分酶或蛋白质能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中,考虑因素:盐浓度、pH(等电点pI)、温度、辅助因子
有机溶剂法:酶与脂质结合得比较牢固,不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中
采用不同比例的有机溶剂进行提取,如:乙醇、正丁醇等
大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中,故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液,如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液(pH