文档介绍：CCK8实验具体操作步骤:,在操作台上用直吸管将铺有细胞的60个孔里面的上清液全部吸掉,再加PBS200ul洗一次,最后将96孔板里面所有的液体全部吸掉。:先加药-----再加无血清培养基-----:加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基1μg/mL组:加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基:2μg/mL组:加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基3μg/mL组:加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基4μg/mL组:加入20ul顺铂+180ul加无血清培养基5μg/mL组:加入20ul顺铂+,放于混匀振荡器上振荡3分钟。。兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养文章来源: 2006-7-1914:41:08兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养第二军医大学学报2000年第21卷第3期徐青镭吴海山周维江摘要目的:评价兔自体骨髓间充质干细胞作为半月板组织工程重建中种子细胞的可能性。方法:采用体外细胞培养技术将兔骨髓间充质干细胞自骨髓血中分离、纯化和和培养,并研究其增殖及生长特征。结果:原代培养及传代培养显示,兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。结论:兔自体骨髓间充质干细胞生物年龄较为年轻,用作半月板组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。关键词:间充质干细胞;骨髓;半月板骨髓组织中除含有造血干细胞外,还含有多量的间充质干细胞(MSC)。如同多能造血干细胞的存在赋予骨髓组织以强大的造血功能以维系血液系统的新陈代谢一样,这些MSC的存在为骨软骨组织的损伤提供了潜在的修复能力。但是与造血干细胞相比,骨髓中MSC的含量并不丰富。本实验拟通过体外细胞培养的方法将MSC自骨髓血中分离出来并加以纯化,并进一步在体外培养条件下研究其增殖及生长特性,从而探讨为半月板的组织工程重建提供种子细胞的可能性。 1 材料和方法 兔骨髓MSC的分离取成年新西兰兔10只,6个月龄,雌雄不拘,(~);用3%戊巴比妥钠按1mg/kg的剂量施以全身麻醉,另用1%利多卡因于手术部位施以局麻;无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2~3mm的孔,使通达髓腔;用18号硬膜外穿刺针接5ml注射器,内含3000U/,沿骨皮质上的孔穿入髓腔,抽出骨髓血约2ml;抽出的骨髓血用平衡液洗涤两次后,离心180×g,5min;弃去上清液,沉淀用Hamf12-10%FBS培养液重新打匀;∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中,4℃下保留10min,取出再离心180×g,5min;弃去上清后,以几滴平衡液再悬浮后,用细胞计数板作细胞计数,确认有核骨髓细胞量达106~107后,即可进行原代培养接种用。 兔骨髓MSC的原代培养将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于6孔培养板内,加入Hamf-12培养液,于37℃,10%CO2条件下培养;于接种5d后进行第1次换液,以后隔日换液。每天随机抽取3只实验动物的MSC作细胞生长动力学分析,%胰酶-1mmol/LEDTA液将贴壁细胞消化分离(37℃、3~5min),并作贴壁细胞计数,直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底部。将此3个实验动物MSC每天的细胞计数取平均值,作原代细胞培养的生长曲线分析。 兔骨髓MSC的传代培养原代培养一旦铺满整个培养孔的表面,%胰酶-1mmol/LEDTA液将贴壁细胞消化分离(37℃、3~5min),然后按1∶3的比例进行传代接种培养,并记为P1;传代培养过程中隔日换液,直至贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养孔的底面。再重复以上操作,%胰酶-1mmol/LEDTA液将贴壁细胞消化分离(37℃、3~5min),并按1∶3的比例进行下一代传代接种培养,并记为P2,余类推。将随机抽取作原代培养细胞生长动力学分析的3个实验动物MSC的P1代分为两组,一组连同其余样本的第1代一并留作后续实验用,另一组则用