文档介绍：蚃蕿芆Ⅰ:PCR(基因扩增技术)芆莄蒃基因扩增技术(PCR)聚合酶链反应(polymerasechainreaction简称PCR)又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品,因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点,已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。腿薀蒁 PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创造的,主要贡献者为KaryBmulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来,PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人KaryB、mulis获1993年诺贝尔化学奖。资料个人收集整理,勿做商业用途薈袄羁为了使PCR技术在临床上迅速得以普及,我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革,使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染,从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。资料个人收集整理,勿做商业用途袀莈羇蚆芃薅一、PCR的基本原理和基本程序薀葿袃 PCR扩增DNA的原理是:先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链,然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物,即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DN***段,一般需20-30个碱基对,过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后,以靶DNA单链为模板,经反链杂交复性(退火),在TaqDNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷(dNTP)为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用,而且起着特异性的限制扩增DN***段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列,并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程,使每次循环延伸的模板又增加1倍,亦即扩增DNA产物增加1倍,经反复循环,使靶DN***段指数性扩增。资料个人收集整理,勿做商业用途袅蚂莀 PCR的扩增倍数Y=(1+E)n,这里Y是扩增量,n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次,靶DNA将扩增到33554432个拷贝,即扩增3355万倍:若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝,即扩增产物约丢失93%,若E=100%,n=20,则扩增数量减少1048576个拷贝,扩增产物约减少97%。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。PCR扩增属于酶促反应,所以,DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DN***段的扩增最初表现为直线上升,随着靶DN***段的逐渐积累,当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时,酶的促化反应趋于饱和,此时靶DNA产物的浓度不再增加,即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率,起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量,dNTp浓度,非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。资料个人收集整理,勿做商业用途莀蒁螇二、PCR的特点***肂节(一)特异性高:首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymeraseI的Klenow大片段,其酶活性在90℃会变性失活,需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段,同时引物是在37℃延伸(聚合)易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差,1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的TaqDNA聚合酶,在热变性处理时不被灭活,不必在每次循环扩增中再加入新酶,可以在较高温度下连续反应,显著地提高PCR产物的特异性,序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中,单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一,足可以提供特异性分析,选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。资料个人收集整理,