文档介绍：:..硕士学位论文解淀粉芽胞杆菌X030抑菌与抗肿瘤活性研究学科专业微生物学学位类型R科学学位£专业学位研究生姓名何浩导师姓名、职称丁学知教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二〇-tumoractivitystudiesofBacillusamyloliquefaciensX030研究生姓名何浩指导教师姓名、职称丁学知教授学科专业微生物学研究方向微生物新药物湖南师范大学学位评定委员会办公室二〇一五年五月摘要芽胞杆菌分布广泛,易分离培养,生长周期短,繁殖速度快,在生长繁殖过程中产生的活性物具有抑菌、杀虫和抗肿瘤等生物功能。从全国各地采集的72份土样中筛选出339株芽胞杆菌,经抑菌与抗肿瘤活性检测,结合形态观察、生理生化特征和16SrRNA基因Blast同源序列比对分析,确定了一株高毒力解淀粉芽胞杆菌新菌株,命名为BacillusamyloliquefaciensX030,简称BaX030(O:M2014159);通过多步分离纯化得到抑菌活性多肽和抗肿瘤活性小分子。BaX030发酵培养48h,收集上清液,经蛋白纯化(AKTAPurifier10)分离,超高效液相色谱(Agilent1290Infinity)分析,高效液相色谱(Agilent1260Infinity)制备,得到纯的抑菌组分B2和抗肿瘤活性物BAH1,LC-MS/,。经不同温度和pH处理上清液,用滤纸片法对金黄色葡萄球菌与白色念珠菌等七种病菌进行抑菌实验;对峙培养法对辣椒尖胞炭疽病菌与枇杷炭疽病菌等六种植物病原真菌进行拮抗实验,结果显示:上清液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及辣椒尖胞炭疽病菌、枇杷炭疽病菌等具有较好的抑制效果;且抑菌活性在常温、强酸和中性条件下最好,高温与强碱处理活性降低;BaX030与辣椒尖胞炭疽病菌对峙培养发现,随着培养时间推移孢子出现变黑、变小、变少、内含物释放和裂解现象;与植物病原菌对峙培养十天,形成环状包围圈,辣椒尖胞炭疽病菌与枇杷炭疽病菌菌丝变黑基本停止生长。BAH1(8μg/mL)分别作用于小鼠黑色素瘤细胞(B16)、人宫颈癌细胞(Hela)、人肝癌细胞(Hep-3B)和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)。MTT数据显示,三种肿瘤细胞增殖受到明显抑制,且具有浓度依赖性,对HUVEC细胞增殖影响相对肿瘤细胞较小。倒置显微镜观察细胞形态;同时用Hochest33342、tubulinAlexaFluor488和MitoTrackerRedCMVRos对细胞进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜(Confocal)观察亚细胞结构,结果显示:处理组肿瘤细胞形态和结构都发生明显变化,出现细胞皱缩变圆,骨架破坏,细胞核形态不规则,线粒体裂解等现象,处理组HUVEC细胞与阴性对照相比变化不大。上述结果表明,BAH1对肿瘤细胞毒性强,能使细胞骨架和线粒体严重受损,而对正常细胞毒性相对较弱。关键词:解淀粉芽胞杆菌;抑菌活性;分离纯化;小分子物质;抗肿瘤活性AbstractBacillushasaseriesofcharacters,suchaswidedistribution,easyisolation,,whichhavebiologicalactivitiesincludingantimicrobial,insecticidalandanti-,anewBacillusstrainnamedBacillusamyloliquefaciensX030(O:M2014159)ordingtomorphologicalobservation,physiologicalandbiochemicalcharacteristics,-