文档介绍：菠萝中提取菠萝蛋白酶
组员:李志杨许明陈俊驰魏来彭海
微生物09301班
分离纯化第二组
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背景知识
菠萝蛋白酶是从菠萝皮和菠萝肉中提取到的一种蛋白酶,菠萝蛋白酶的生产可解决菠萝产业中大量废料被丢弃造成的环境污染和资源浪费问题,还可使菠萝产品高值化利用。由于菠萝蛋白酶对环境条件的敏感性,在其生产过程中活性易失,使得生产效率降低。
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菠萝茎和菠萝皮的含水量都达到85%以上,但菠萝茎的榨汁率比菠萝皮的榨汁率低。菠萝皮和菠萝茎中的糖分含量占总干重的80%左右,其中菠萝茎中淀粉占总糖份量的一半。离心可以有效去除榨汁中的不溶物质及菠萝茎中的淀粉,能部分去除果胶,对一些大分子悬浮物质去除困难。
准备知识
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背景知识
菠萝蛋白酶在避光、低温条件下贮藏的酶活力损失最小。在55℃时具有最高的蛋白酶活性,40℃以上条件下酶活半衰期在2h以内,其热变性温度在55℃和60℃之间。
金属离子对菠萝蛋白酶的酶活力具有影响,Ca2+引起的酶的失活速度最快;Fe2+和Cu2+对酶活力影响最大。
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准备知识
在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好。
菠萝蛋白酶提取时,pH值为6. 5~,温度为6 0℃,菠萝蛋白酶的活性最强,可作为最佳提取条件。
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实验原理
蛋白质与单宁作用可以发生沉淀反应,所以可以用单宁提取菠萝蛋白酶。
通过比活力测定菠萝蛋白酶的含量。
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实验所需材料与仪器
实验用菠萝采自超市,以7~9分成熟为标准
菠萝肉各部分分别经打碎、榨汁、纱布粗滤、离心(4 000 r/ min ,10 min) 后得澄清液,存放于冰箱中备用
5%柠檬酸钠维生素c 单宁%EDTA溶液%***化钠溶液1%酪蛋白溶液1mol/L氢氧化钠溶液(溶解磷酸二氢钾,) 激活剂(,,内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用)
榨汁机、离心机、分光光度计、水浴锅
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方法及流程
鲜果肉汁混合液
上清液混合液
沉淀物酶糊复合物
5%柠檬酸钠液
混匀 10min
离心4000r/min
7min
%单宁
边加边搅 15min
静止40min
离心4200r/min
5min
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分离、洗涤和保护
把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中,加 0. 1 %EDTA 溶液 100 ml 搅匀,再将1. 5%***化钠溶液 200 ml 倒人烧杯中搅匀,以4200 r/ min离心5min ,倒掉上清废液,得到洗涤剂Ⅰ酶复合沉淀物。
把洗涤剂Ⅰ酶复合沉淀物倒入烧杯中,加0. 5%乙酸锌溶液20 min ,搅拌均匀,静止5 min ,加0. 06 %抗坏血酸溶液30 ml ,搅匀,静止5 min ,加1. 5 %***化钠溶液 20 ml ,搅匀,静止5 min ,最后再加 0. 5 %EDTA 溶液 20 ml ,搅匀,静5min ,以 4 000 r/ min 离心 7 min ,把上清废液倒掉,得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
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考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量
试管号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准蛋白
()
0
0
待测酶蛋白
0
0
0
0
0
0
0
磷酸缓冲液
0
0
考马斯亮蓝
4
4
4
4
4
4
4
4
吸光度A
0
(稀释5倍)
一、按如下表格制作标准曲线
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