文档介绍：山西医科大学
硕士学位论文
大鼠脑组织匀浆对其BMSCs向神经元样细胞分化的影响
姓名:陈文超
申请学位级别:硕士
专业:神经病学
指导教师:李光来
2011-03-15
山西医科大学硕士学位论文

大鼠脑组织匀浆对其 BMSCs 向神经元样细胞分化的影响
中文摘要
目的:骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一类具
有向神经细胞分化能力的多潜能干细胞,可应用于神经功能缺损的细胞移植治疗。本实验
研究骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增的特点,旨在培养出高纯度的骨髓间充质干细
胞。探讨大鼠脑组织匀浆上清液对 BMSCs 向神经元样细胞分化的影响,在以碱性成纤维细
胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)为基础的诱导液中分别加入正常和损伤
大鼠脑组织匀浆上清液,观察各组神元样细胞的诱导率及诱导后细胞活力的差异。
方法:无菌条件下取大鼠股骨和胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法对骨髓间充质干细
胞进行体外培养和传代,选取第 3 代、第 5 代和第 7 代骨髓间充质干细胞接种于 96 孔板,
连续 10 天每天同一时间计数各代的细胞数,绘制细胞生长曲线图。采用流式细胞仪检测
第 4 代骨髓间充质干细胞表面的 CD29,CD44 和 CD45 抗原的表达。取第 4 代的 BMSCs,按
105/ml 浓度接种于 6 孔板和 96 孔板内,以 1mmol /L 浓度 BME 和含 20%血清的 DMEM 培养基
预诱导 24 h 后,分别加入 bFGF 20ng/ml、bFGF 20ng/ml+正常大鼠脑匀浆上清 100ul/ml、
bFGF 20ng/ml+损伤大鼠脑匀浆上清 100ul/ml,诱导至细胞分化,另留取空白对照组不加
任何诱导剂。细胞培养及诱导过程中每天在倒置显微镜下连续观察其形态变化。取 6 孔板
内各组诱导后 48h 的细胞进行爬片,采用免疫细胞化学染色的方法分别检测各组诱导分化
后细胞神经元特异性烯醇化酶(Neural-specific enolase, NSE)、微管相关蛋白-2
(Microtubule associated protein 2, MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary
acidic protein, GFAP)的表达,计算出诱导阳性率。取 96 孔板内诱导后的细胞用 MTT 法
检测各组诱导后 5h、24h、48h、3d、5d 诱导后细胞的生长状况。
结果:倒置显微镜下观察可见培养 24h 后部分细胞贴壁呈多角形,72h 后贴壁细胞增
大、分裂增殖,2 周左右细胞汇合至 70%~80%,此时可传代。传代 24 h 后 BMSCs 即可贴
壁生长,约 5 d~7 d 可铺满瓶。此后随着换液、传代,细胞逐渐表现为排列旋涡状、菊
花状的均一梭形。第 3、5、7 代细胞生长曲线测定显示这 3 代细胞具有相同的生长特性,
表现为传代后约两天为潜伏期,细胞生长缓慢,第 3 天进入指数生长期,这一时期持续到
第 8 天,此后进入平台期;随着传代次数的增多,细胞增殖速度有减弱趋势。流式细胞术
检测第 4 代 BMSCs 结果为 CD29、CD44 和 CD34 的表达率为 %、 %和 %。BMSCs
预诱导 24h,可见少量细胞逐渐向胞核方向收缩,加入各诱导剂后上述变化增多,有突起形
成并随时间增长,部分视野可见突起交织成网状,对照组细胞形态无变化。免疫细胞化学
II
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染色可见各诱导组细胞均有部分细胞 NSE 和 MAP-2 阳性,GFAP 阴性。对照组均不表达 NSE、
MAP-2 和 GFAP。计算各组细胞的诱导阳性率为:bFGF 诱导组 NSE 的表达率为 %,MAP-2
的表达率为 %;正常大鼠脑组织匀浆上清诱导组 NSE 的表达率为 %,MAP-2 的表
达率为 %;损伤大鼠脑组织匀浆上清诱导组 NSE 的表达率为 %,MAP-2 的表达率
为 %。MTT 结果显示加入脑组织匀浆上清的细胞生长状况好于对照组,其中损伤匀浆
组的细胞活力更好。
结论采用全骨髓贴壁培养法可以培养出高纯度的骨髓间充质干细胞,第 3、5、7 代
细胞的生长特性基本相同,传代后均经历潜伏期、指数生长期和平台期,随着传代次数的
增加,细胞增殖有减弱的趋势。大鼠脑组织匀浆上清液能提高其骨髓间充质干细胞向神经
细胞方向的分化的阳性率和诱导后细胞的活力。相比于正常脑组织匀