文档介绍：y大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道的电生理学特性
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的:研究大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道的电生理学特性。方法:用急性酶分离法分离单个大鼠肺动脉平滑肌细胞,采用全细胞膜片钳技术对肺动脉平滑肌细胞钾通道的电生理学特性进行研究。结果:在一定的实验条件下可记录出钙激活性钾电流(Kca)和电压门控性钾电流(Kv)。Kca可被四乙胺阻断,Kv电流由快速失活K+电流(Ka)、缓慢失活钾电流(Kst)和延迟整流K+电流(KDR)以不同比例复合而成,可被四氨基吡啶所阻断。结论:利用膜片钳技术研究发现,低氧通过作用K+通道引起肺动脉平滑肌细胞收缩。
【关键词】大鼠;肺动脉;平滑肌细胞;k+通道;全细胞膜片钳
迄今大多数学者认为低氧性肺动脉高压(PAH)以及低氧性肺血管收缩(HPV)的发病机理是由于低氧抑制了平滑肌细胞膜上的钾离子通道,使细胞膜去极化,从而激活电压门控的钙通道,引起细胞外钙离子内流,致肺动脉平滑肌细胞收缩,从而启动HPV[1]。K+通道既是PAH和HPV发病过程中的重要环节,也是药物作用的重要靶点[2]。基于此,我们利用传统的全细胞膜片钳技术对急性分离的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PaSMCs)k+通道的电生理学特性进行了研究,旨在进一步阐明PAH和HPV的发病机理,为药物的开发和利用奠定基础。
1 材料与方法
实验动物
成年雄性Wistar大鼠,体重270
±30g(购于四川大学医学实验动物中心)。
试剂
试剂:胶原酶Ⅺ、HEPES、小牛血清白蛋白、papain、四乙胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)、EGTA、dithiothreitol(DTT)等试剂购于SIGMA公司,其余试剂为国产分析纯。
溶液配制: 细胞分离液(HPSS)(mmol·L-1):NaCl 130,KCl 5,MgCl2 ,HEPES 10,Glucose 10,PH (with NaOH);低钙的HEPES液:CaCl2 20umol/L;电极内液(mmol·L-1):KCl 110,MgCl2 ,Na2ATP ,HEPES 10,EGTA 10,PH 。
仪器和材料
解剖显微镜(OLYMPUS SZX12,Japan)、倒置相差显微镜(OLYMPUS IX70,Japan)玻璃微电极拉制仪(Sutter Instrument co, USA)、毛细玻璃微管电极(硬质,购于中国科学院电子所)、玻璃微电极抛光仪(NARISHIGE,Japan)、膜片钳放大器(Axon Instruments,USA)、电子三维微操纵仪(Sutter Instrument co,USA)、12位A/D
D/A数模转换器(Digidata 1200 series Interface, USA)、膜片钳刺激程序设置和电信号数据记录软件:、膜片钳电信号数据处理和分析软件:Clampfit (Axon Instruments, USA)。
大鼠肺动脉平滑肌细胞的急性酶分离
单个大鼠肺动脉平滑肌细胞的获得参照Smirnov、肖欣荣等使用的急性酶分离法分离[3-4]。大鼠用1%戊巴比妥钠以33 mg·kg-1的进行腹腔麻醉后剖胸,游离支气管、心脏和肺,放在细胞分离液(4℃)HPSS中,清洗淤血后,将标本置于冰浴的琼脂盘上,在体视显微镜下沿着右心室分离出左右肺动脉,清理结缔组织,顺肺动脉主干分离肺动脉的分支, 去掉肺动脉主干及1级分支,最后保留2-4级肺动脉分支(φ1000 μm)。将动脉管沿纵行方向剖开,将血管壁剪成1×1mm2的组织小片。(CaCl2 20 μmol·L-1),内含胶原酶Ⅺ 1 mg·ml-1,木瓜蛋白酶1mg·ml-1,小牛血清白蛋白2mg·ml-1,DTT 1 mM·L-1,在37℃的恒温水浴箱中孵育酶解40 min,低速离心(1000gr·M-1)5 min,无钙HPSS液洗涤两次后低速离心5 min,弃上清液,加入低钙HEPES液4 ml,用尖端抛光、开口较大的Pasteur吸管轻柔地吹打20 min,即得到单个的肺动脉平滑肌细胞。
大鼠肺动脉平滑肌细胞全细胞膜片钳记录
选择细胞形态自然、包膜光滑、包质均匀、折光性好的平滑肌细胞进行全细胞膜片钳记录[5-7]。反向将经过过滤的平滑肌细胞电极内液冲灌电极,用微操纵仪移动电极进入平滑肌细胞细胞外液中。细胞封接时,让电极接触细胞表面,轻压成小凹,缓慢释放预先施加在电极内的正压,如果细胞状态好,在30-60s的时间内里即能形成高