文档介绍：安徽农业大学
硕士学位论文
原料乳中两种病原菌双重PCR检测方法的建立与应用
姓名:邵士慧
申请学位级别:硕士
专业:营养与食品卫生学
指导教师:李槿年
2011-06
摘要
近年来,随着乳制品行业规模化生产的快速发展,由乳及乳制品的安全问题所引
发的乳源性疾病,特别是细菌性食物中毒事件时有发生。因此,对乳源性病原菌的检
测研究受到了前所未有的重视。大量研究结果表明金黄色葡萄球菌(us
aureus)和致病性大肠杆菌(pathogenic Escherichia coli)是污染原料乳的两种最常见的
人畜共患病病原菌,它们通过引发乳及乳制品的腐败变质,进而导致人畜共患病和人
类食物中毒的发生。为此,加强原料乳及乳制品中金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌
的检测对预防和控制乳源性疾病的发生和流行显得至关重要。本研究在建立可同步检
测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR方法的基础上,对合肥地区采集的新
鲜原料乳以及市售乳制品进行上述两种病原菌检测,以期探明原料乳及乳制品的污染
状况。
首先,建立了检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的单一PCR方法。选取金黄
色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因和致病性大肠杆菌粘附素K99基因作为检测目的基因,
根据nuc基因和K99基因的保守区序列,。
在其他因素不变的条件下,通过对引物浓度、模板浓度、退火温度和Mg2+浓度的摸索,
确定了金黄色葡萄球菌单一PCR检测方法的最佳条件是:在25μL反应体系中加入10
×PCR Buffer ,dNTPs ,Mg2+(25mM),,引物(20 pmol)
,Taq DNA聚合酶(5U/μL),。各成分混合后进行95 ℃预
变性10min,94 ℃变性45s;58 ℃退火30s;72 ℃延伸30s,共循环30次,最后72 ℃
后延伸5min。致病性大肠杆菌单一PCR检测方法的最佳条件是将退火温度降至56 ℃,
其余条件同上。
其次,建立了可同时检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR方法。在
单一PCR检测方法的基础上,采用正交试验对引物浓度、Mg2+ 浓度、模板浓度和退火
4
温度在4个水平上进行L16(4 )优化试验,确定了双重PCR方法的最佳条件为:25μL
反应体系中,10×PCR Buffer ,dNTPs ,Mg2+(25mM) ,DNA模板
终浓度比为1:1、引物终浓度比为1:3,Taq DNA聚合酶(5U/μL) ,,
各反应物混合均匀后于95 ℃预变性10min,94 ℃变性45s;58 ℃退火30s;72 ℃延
伸30s,共循环30次,最后72 ℃后延伸5min。
再次,利用建立的双重 PCR 方法检测人工模拟样品,验证其实际应用的可行性。
使用微孔滤膜过滤富集样品中的菌体后,采用改良 DNA 提取法抽提模板进行双重
PCR 检测。结果显示无需对样品进行培养,即可从富集后的样品中检测出目的基因。
从样品的富集到 PCR 产物的检测,整个过程大约需要 6h 左右,且两种病原菌的最低
I
检测限均达到 102 CFU/mL。表明建立的双重 PCR 方法具有较好的应用可行性。
最后,采用建立的双重PCR方法对从合肥地区采集的152份新鲜原料乳和50份市
售乳制品进行检测,同时以国标法进行对比验证。结果从50份市售乳制品中均未检测
出两种病原菌。在所检测的152份新鲜原料乳中,双重PCR方法和国标法检出金黄色
%%,%
%,%%。两种方法检出金黄
%%,同时检出两种病原
%。结果表明,该双重PCR方法灵敏度高、结果准确可靠、且无漏
检现象。
综上所述,本研究建立的同步检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR
方法特异性强、灵敏度高、检测周期短,可用于乳及乳制品中两种病原菌的快速检测。
检测结果表明,合肥地区原料乳中金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的污染程度较
高,应重视乳制品的质量安全问题。
关键词:乳源性疾病,金黄色葡萄球菌,致病性大肠杆菌,双重PCR检测
II
Abstract
In recent years, with t