文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
基于纳米金探针的全氟化合物生物检测技术研究
姓名:王春香
申请学位级别:硕士
专业:劳动卫生与环境卫生学
指导教师:徐顺清
2011
华中科技大学硕士学位论文
基于纳米金探针的全氟化合物生物检测技术研究
硕士研究生:王春香
导师:徐顺清教授
中文摘要
近年来,全氟化合物(pounds, PFCs)在工业生产和生活消费领
域中应用越来越广,由此产生的环境污染问题日趋严重。其中,全氟辛烷磺酰基化合
物(Perfluorooctane sulfonates, PFOS)和全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid, PFOA)是环
境中最典型、污染最重的,也是多种其他 PFCs 在环境中的最终代谢产物。鉴于 PFCs
的健康危害性,近年来欧美发达国家已发出一系列的关于 PFOS、PFOA 等的销售及使
用限令。当前 PFOS 已在相关出口产品中被广泛限制,成为继二恶英之后的又一绿色
壁垒。加强对 PFCs 的检测是控制这些污染物及防治其健康危害的基础和必需手段,对
我国环境保护、居民健康和国民经济发展具有重要意义。
到目前为止,PFCs 的检测方法主要是化学分析法,如色谱法。但色谱法检测过程
复杂、检测周期长、费用高,适用于要求精确定量的场合。理想的 PFCs 检测程序应该
是先利用一种简便的方法对待检样品进行初步的筛选,如果 PFCs 超过规定的标准,再
利用色谱法检测具体的 PFCs。因此,急需建立一种简便、快速、经济且易于实施的检
测 PFCs 的新方法,以适应大规模样本筛查及长期环境监测的需求。
本研究根据 PFCs 与 PPARα核受体相互作用形成的配体-PPARα/RXR 复合物能与
PPARα反应元件(PPARα response element, PPRE)核酸序列特异性结合的特性,利用
纳米金探针以及银染增强技术的高灵敏度,借鉴配体受体相互作用和转录因子结合顺
式反应元件的思路,将二者结合起来,建立一套全新的微量 PFCs 的快速分析方法,称
为结合银染增强的纳米金-PPRE 探针生物检测法,简称纳米金-PPRE 探针法。
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第一部分建立纳米金-PPRE 探针法检测体系
目的:本部分旨在建立一种新的鉴定PFCs并进行定量研究的生物检测方法——纳
米金-PPRE探针法,能作为大量样本的预筛手段,可广泛用于基层实验室。方法:本研
究基于PFCs与PPARα特异结合的这一特性,利用纳米金探针银染增强技术的高灵敏度,
建立一套全新的微量PFCs的快速分析方法。以最具代表性的PFOS作为研究对象,通过
固定anti-PPARα抗体于微孔板上,用PFOS激活PPARα受体形成PFOS-PPARα/RXR复合
体,并加入到微孔板中,然后加入纳米金-PPRE探针进行检测;通过检测与PFOS激活
的PPARα结合的PPRE-纳米金颗粒并被银染增强液增强后的信号来定量检测PFOS。绘
制PFOS浓度与OD值之间的剂量-效应关系曲线。本部分研究对实验条件进行了优化,
并与标准分析方法高效气相色谱-质谱联用技术(HPLC/MS)进行了比较,以及利用该
方法检测了其他的PFCs,如PFOA。结果:(Ⅰ)通过Western blot方法检测肝细胞核提
取产物,验证了核提取产物中PPARα蛋白的提取效果良好;(Ⅱ)建立时间-剂量-反应
曲线,确定最佳银染增强显色时间为 3min;(Ⅲ)定量研究可得到PFOS剂量-效应关系
曲线,在一定范围内(100 pM-1 µM)PFOS诱导产生效应(OD值)与PFOS浓度之间
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呈良好的线性相关(R =),EC50约为 10nM,最低检测限为 10 pM;(Ⅳ)检测结
果与HPLC/MS比较具有良好的一致性;(ⅴ)利用该方法检测了其他的PFCs也取得了
良好的结果。结论:纳米金-PPRE探针法具有灵敏、快速、经济、简便的特点,仪器设
备方便易操作,结果与HPLC/MS具有可比性,是一种新颖而实用的检测PFCs的生物分
析方法。
第二部分纳米金-PPRE 探针法检测环境和生物样本中的全氟
化合物
目的:利用纳米金-PPRE 探针法定性和定量检测环境水样和血清生物样本中的
PFCs。方法:将采集的水样和生物样本分别经过一定的前处理过程后,溶于 DMSO,
然后以 PFOS 为标准物质采用纳米金-PPRE 探针法检测制定标准曲线,并同时用纳米
金-PPRE 探针法检测样本中 PFCs 所产生的效应,从标准曲线中查出各组检测样本中相
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华