文档介绍：数字PCR可行性分析数字PCR技术的原理数字PCR(DigitalPCR-dPCR)技术是一种新的核酸检测和定量方法,与传统走量PCR(qPCR)技术不同,数字PCR采用绝对走量的方式,不依赖于标准曲线和参照样本,直接检测目标序列的拷贝数。由于这种检测方式具有比传统qPCR更加岀色的灵敏度和特异性、精确性,dPCR迅速得到广泛的应用,这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面变现出的优势已被普遍认可,而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴走、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴走、转基因成分鉴走、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。数字PCR采用的策略概括起来非常简单,就是“分而治之"(divideandconquer)【1】,这种做法非常类似于计算机科学中的“分治算法J将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中,在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),实现“单分子模板PCR扩增",扩增结束后,通过阳性反应器的数目“数岀”目标序列的拷贝数。在实际的数字PCR实验中,事实上是通过呈现两种信号类型的反应器比例和数目进行统计学分析,计算岀原始样本中的模板拷贝数。ooooooooooooooooo・8•ooo•oeosamplepartitionedintomanyreactions•,因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对走量检测;此外,由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态,因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点,完全不依赖于Ct值的鉴定,因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高;数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度,因此数字PCR技术也特另!]适合在复杂背景中检测稀有突变。数字PCR技术的发展历史从原理可以看出,数字PCR与传统的定量PCR两者皆定位于同样的平台基础——聚合酶链式反应和双链DNA标记技术,但两者采用的是完全不同的定量策略和思想方法zdPCR和qPCR并没有实验方法和思路上的承继关系,从这个角度来说,目前很多人把数字PCR称为第三代PCR技术并不准确。在实时定量PCR技术成熟和发展之前,早在1992年,南澳洲弗林德斯医学中心的科学家使用有限稀释、PCR和泊松分布数据校正模型的方法(limitingdilution,PCRandPoissonstatistics)z检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因进行了极其精细的定量研究[2],虽然当时这种方法并没有被冠以“数字PCR”之名,但已经建立了数字PCR基本的实验流程,更重要的是了数字PCR检测中—个极其重要的原则以“终点信号的有或无"(all-or-noneendpoint)作为判断标志,这也是之后1999年BertVogelstein和KenKinzler将之命名为“数字PCR^digitalPCR)的主要原因[3】。数字PCR技术的原理非常简单,然而在样品分散(divide)的环节上却遇到了无法突破的瓶颈。早期的dPCR尝试使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作为分散反应的载体,或者采用类似流式技术的磁珠乳液扩增方法(BEAMing-Beads,Emulsion,Amplification,ics),2006年Fluidigm公司推出了第一台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国Inostics推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMingdPCR检测服务,但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法达到更加精细的要求,时间和耗材成本严重限制了dPCR技术的发展。近几年来,随着纳米制造技术和微流体技术nanofabricationandmicrofluidics)的发展,数字PCR技术遇到了突破技术瓶颈的最佳契机。1997年Kalinina,.BrownJ,和SilverJ使用纳升级芯片进行单克隆模板PCR扩增获得了美国专利,更重要的是这种采用“电浸润法"进行纳升级芯片制造技术显露雏形【4]。伴随二代测序技术发展起来的“油包水PCR”技术,可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴,可以作为dPCR的样品分散载体。QuantaLife利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术,这也是最早出现的相对成熟的数字PCR平台,在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。20