文档介绍：现象原因解决反影(白色条带,黑色背景)1HRP过高(背景较高)至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色2HRP过高(敏感性太高)至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无3HRP过高引起底物迅速耗竭至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注34抗体-抗原系统敏感性过低提高抗体浓度/蛋白上样量*注45转膜不充分/过转优化转膜条件*注56HRP或底物活性降低测试活性或选用敏感底物*注6高背景7HRP过高(背景较高)至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注78封闭时间不足延长封闭时间4度过夜最好*注89抗体与封闭液有交叉更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注910TBST洗脱不足增加洗脱时间、次数、用量*注1011暴光时间过长降低暴光时间*注1112抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点13转膜不良(如有气泡在胶-膜之间)精细操作*注1314膜平衡不均/油脂污染按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注1415膜与X光片间有气泡显影前去除气泡*注15非特异性条带16抗体交叉反应至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1617SDS非特异性结合蛋白条带使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑18封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀,仅用上层*注18*注1其具体问题有二:一是背景较高,,则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决,要么动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,原因和上面的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带,但与上面的区别主要在于特异性要好一些,若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。*注2其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在,只是一种现象,在压过的膜可以看出来(只在加底物后一段时间出现,几小时后可能还会消退,有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来,所以要把握时机)。如果没有达到原因1和原因3的程度,那么这种情况一定能够看到很强的荧光,是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大,所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决,一般压10s~30s,甚至可以3~5s,即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况,就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大(如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡,这样就不可取了,但依然是粗大的、非条带的本来面目),那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度(减少上样量很不稳定且能力有限,故很少使用)来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。*注3这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现,经常与下面的原因4、5、6混淆,特