文档介绍：PEI和PEG对细胞毒害作用的探究
展示者:李苏 3070701016
同组成员:王诗豪 3070701056
实验目的和要求
MTT法测定聚乙烯亚***(PEI)的细胞毒性
MTT法测定PEG的细胞毒性
“细胞毒性”在学术文献中的定义
根据欧洲标准化组织CEN1992年30号文件的定义,细胞毒性是指由产品、材料及其浸渍物所造成的细胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制。
外来化学物质
进入机体
小剂量对机体影响甚微
大剂量造成机体严重后果,甚至导致死亡
实验原理
溴化噻唑蓝四氮唑
MTT
细胞内线粒体酶作用
甲臜
DMSO
570nm测定吸光度
吸光度值与细胞数量呈正相关
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测,常用以下几种方法:
MTT、XTT(一种线粒体脱氢酶的作用底物)法:
利用线粒体内部酶的活性,可以将特定的四唑盐类进行转化,然后通过酶标仪进行检测。
LDH(乳酸脱氢酶)的方法:
通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性,来检测细胞毒性。
其它酶方法:
如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等。
实验步骤
1、细胞接种,将293T细胞接种到96孔板上,每孔约5000个细胞。
2、细胞培养,将培养板放入CO2孵箱,在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下,培养至实验所需的细胞数量(一般为16小时)。
3、吸去培养液,用PBS清洗细胞,加入无血清培养液,在细胞孔中分别加入PEI溶液和PEG溶液,加入PEI的试样使得每孔中PEI的浓度分别为0,5,10,25,50,100,200µg/mL ,加入PEG的试样使得每孔中PEG的浓度分别为0,,,4,20,100,500mg/mL,每孔液体的总体积在200µL。(注意每种浓度都为三复孔,并要有不加任何PEI的对照孔至少3孔)
4、,1,2,3小时。
5、吸去培养液,每孔加入90 l 无血清培养液和10 l的5mg/mL MTT溶液,37℃孵育2-3小时。
6、翻板法弃去液体,每孔加入100 l DMSO,在震荡器上震荡10分钟。
7、在酶标仪上570nm波长测OD值。
8、统计数据。
PEI浓度(ug/ml)
1
2
3
平均值
标准偏差
存活率
0
1
5
10
25
50
100
200
实验结果
1小时
PEI浓度(ug/ml)
1
2
3
平均值
标准偏差
存活率
0
5
10
25
50
100
200
2小时
PEI浓度(ug/ml)
1
2
3
平均值
标准偏差
存活率
0
5
10
25
50
100
20