Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附.doc

文档介绍：Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:王中群崔静李丽华赵卫星赵琪苏蔚申虎位冒冒
【摘要】目的探讨酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL)诱导内皮单核细胞黏附的机制及Calphostin C的干预效果。方法采用体外培养和直接计数法观察荷脂ECV304内皮细胞黏附能力的变化;PepTag○RAssay法定性内皮细胞胞膜蛋白激酶C(PKC)活性状态;RTPCR和Western印迹检测细胞间黏附分子1(ICAM1)和抑制性蛋白κBα(IκBα)表达的变化。结果 ELDL呈剂量依赖性增强内皮单核细胞间的黏附,其活化内皮促进黏附的理想剂量为20~40 μg/ml浓度。另外,ELDL还可显著活化内皮细胞胞膜PKC,下调IκBα的表达而增强ICAM1的表达。应用PKC特异性抑制剂Calphostin C干预后,荷载25 μg/ml ELDL 8 h的ECV304内皮细胞ICAM1表达下调而IκBα则反相上调,黏附能力也在Calphostin C达到100 nmol/L浓度时显著下调,细胞状态明显好转;且200~400 nmol/L Calphostin C基本可以逆转E
LDL对内皮细胞的影响。结论内皮细胞黏附能力的强效促进剂ELDL可能是通过PKC/NFκB/ICAM1发挥作用的,针对PKC靶酶的特异性抑制剂Calphostin C可以有效地抑制由ELDL引起的内皮活化黏附增强。
【关键词】 Calphostin C;低密度脂蛋白,酶修饰;细胞间黏附分子1;黏附;内皮细胞
单核细胞与血管内皮细胞、平滑肌细胞的黏附是动脉粥样硬化性心脑血管病的重要早期事件〔1〕,探讨病理状态下细胞与细胞间的黏附机制,并进而采取相应的干预措施,尤其是早期的药物干预,将会有效地预防该类疾病的发生。为此,本研究拟在课题组前期高脂血症影响内皮功能、促进脂纹和斑块形成的基础上〔2〕,以酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL)处理ECV304人脐静脉内皮细胞,观察其黏附能力及相关指标,细胞间黏附分子1(ICAM1)、抑制性蛋白κBα(IκBα)和蛋白激酶C(PKC)的改变,并进而以PKC的特异性抑制剂Calphostin C进行相应干预,试图为黏附干预药物的体外研究奠定基础。
1 材料与方法
材料与试剂 THP1单核细胞和ECV304脐静脉内皮细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库);Calphostin C(购自Biomol公司)。总RNA提取试剂盒TRIzol(购自上海Sangon公司);ImPromIITM Reverse Transcriptase、PepTag○RNonRadioactive PKC Assay Kit 和BCATM Protein Assay Kit(购自Promega);Master
Mix一管便捷式PCR扩增试剂盒(购自北京天为时代);所有引物(由上海生工生物工程服务有限公司合成);IκBα和ICAM1一抗,Western印迹Luminol Reagent(购自Santa Cruz);辣根过氧化物酶标记二抗(购自武汉博士德生物工程有限公司);其他试剂均为进口或国产分析纯。
低密度脂蛋白(LDL)的分离、酶修饰及鉴定参考文献〔3〕的方法制备ELDL。取新鲜人血浆100~200 ml,加入PDB以防腐抗氧化。置超速离心机作序列超速离心。提纯的LDL在含200 μmol/L EDTA的磷酸缓冲液(PBS)液中透析48 h后,加入胰蛋白酶( μg/ml)和胆固醇脂酶(40 μg/ml)共孵育48h后,获得ELDL。BCA法蛋白定量,鉴定后过滤除菌,调蛋白浓度至1 g/L,4℃保存,1 w内使用。
实验分组本研究分为两个部分,首先以ELDL浓度梯度(0、5、10、20、40 μg/ml)处理ECV304内皮细胞8 h。在观察到内皮细胞黏附功能和胞膜PKC活性的变化后,为了进一步明确ELDL诱导黏附的可能机制以及PKC和黏附的关系,遂以PKC的特异性抑制剂Calphostin C 处理荷载ELDL的ECV304内皮细胞。分组情况:①25 μg/ml ELDL +10 μl DMSO孵育细胞8 h;②25 μg/ml ELDL+25 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h;③25 μg/ml ELDL+50 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h;④25 μg/ml ELDL+100 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h;⑤25 μg/ml ELDL+2