文档介绍：IL12调节蛋白酶激活受体在肥大细胞的表达
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:张慧云林青, 林丽艳, 张忠芳, 杨海伟何韶衡
【摘要】目的: 探讨IL12对肥大细胞蛋白酶激活受体(PARs)表达的影响。方法: 不同浓度IL12刺激肥大细胞后, 在不同时间点, 用实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRTPCR)和流式细胞术(FCM), 在mRNA水平和蛋白水平检测PAR1、 PAR2、 PAR3和PAR4在肥大细胞P815表面和胞内的表达情况。结果: IL12下调肥大细胞膜表面PAR2蛋白的表达, 上调肥大细胞膜表面和胞质内PAR4蛋白的表达, IL12抗体的应用可阻断IL12对肥大细胞PARs蛋白表达的影响; IL12上调肥大细胞PAR1、 3、 4 mRNA的表达, 下调PAR2 mRNA的表达。结论: IL12在过敏性炎症反应中的调节作用可能与IL12调节肥大细胞PARs表达有关。
【关键词】蛋白酶激活受体; 肥大细胞; 实时定量逆转录聚合酶链式反应(qRT PCR); 流式细胞术(FCM)
蛋白酶激活受体(protease activated receptors 或proteinase activated receptors, PARs)是G蛋白偶联受体(G
protein coupled receptor, GPCR)家族中的新成员, 目前在人和小鼠体内共发现了4种PARs, 即PAR1、 PAR2、 PAR3和PAR4, 它们的基因序列于1991、 1994、 1997和1998年被先后克隆出来[1]。有关的研究显示PARs是哮喘、肺水肿和气道高反应性疾病病理生理过程中的重要效应受体, 一些病理情况伴随着PARs表达的改变: 过敏性鼻炎患者鼻黏膜PAR2表达增强, 哮喘患者气道PAR2表达增强, 小鼠气道病毒感染时PAR1和PAR2表达上调。尽管有研究显示扁桃体、皮肤、和结肠来源的肥大细胞表达PAR2, 然而仍缺乏PAR对肥大细胞功能影响方面的研究。抑制Th2细胞克隆、调节Th1细胞分化, 调节先天免疫反应、决定后天免疫反应的类型和持续时间的IL12亦与过敏反应的发生有关[2, 3]。因此我们首先探讨炎症性细胞因子IL12对肥大细胞PAR表达的调节作用为进一步探讨PAR表达对肥大细胞功能影响的研究奠定基础。
1 材料和方法
材料小鼠肥大细胞株P815(美国标准培养物保藏中心, )。青链霉素、 PBS(10×)、牛血清白蛋白(BSA, V级)和多聚甲醛均购自Sigma公司, DMEM、胎牛血清和TSTIM购自HyClone公司, TRIzol Reagent购自Invitrogen公司, ExScriptTM RT试剂盒、 SYBR Premix Ex TaqTM(perfect real time)和PCR Marker购自TaKaRa公司, IL12和抗IL12单克隆抗体(mAb)购自RD公司, FITC
标记的羊抗鼠PAR2 mAb、兔抗鼠PAR1 mAb、兔抗鼠PAR3多克隆抗体、兔抗鼠PAR4多克隆抗体购自Santa Cruz公司, FITC标记的羊抗兔多克隆抗体购自BD Pharmingen公司, 琼脂粉购自BBI公司, SYBR Green I核酸凝胶染料购自BMA公司。细胞培养箱购自德国Heraeus, 生物安全柜HFsafe 1200购自Heal Force公司, 台式高速冷冻离心机centrifuge 54158、 58108购自eppendorf公司, 紫外分光光度计Smart Spec 3000 和电泳仪购自BIORAD公司, PCR扩增仪PTC200购自MJ Research公司, 凝胶成像分析系统购自SYNGENE公司, FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司, ABI PRISM 7700型荧光定量PCR扩增仪购自ABIPE公司。
方法
肥大细胞培养与激发 P815细胞接种于75 cm2培养瓶(Falcon)内, 完全培养液(DMEM内含4 mmol/L的L谷氨酰胺、 g/L碳酸氢钠、 g/L葡萄糖、 100 mg/L FBS、 100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。以上细胞经无血清培养6 h后用不同浓度的IL12(~100 μg/L)及IL12阻断抗体(10、 30 mg/L)处理细胞, 分别于2 h、 6 h或16 h终止反应, 4℃条件下450 g离心10