文档介绍：KiSS 1基因重组真核质粒的构建、鉴定及其表达
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:徐玫芳臧盛兵黄爱民刘景丰高凌云高美钦
【摘要】目的构建KiSS1基因重组真核质粒,97H细胞中,获得瞬时表达的细胞株,为进一步研究KiSS1基因对人肝癌细胞侵袭转移的影响奠定基础。方法 Trizol试剂法提取新鲜胎盘组织总RNA,经RTPCR扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接,,采用脂质体介导转染技术将高纯度的KiSS1质粒转染到人高转移肝癌细胞株中,用RTPCR和Western blot技术加以鉴定。结果 RTPCR获得预期大小的特异性DNA片段,经PCR、双酶切鉴定及测序,证实已将KiSS1基因cDNA片段正确插入真核表达载体中;RTPCR、免疫细胞化学和Western blot证实KiSS97H细胞中。1重组质粒和瞬时表达KiSS1基因的肝癌细胞,为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础,为体内外实验研究KiSS1对人肝癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。
【关键词】肿瘤抑制蛋白类遗传载体转染肝肿瘤肿瘤侵润真核细胞核质粒
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,居男性恶性肿瘤第3位,病死率高,为恶性肿瘤的第二死因[1]。HCC易发生早期侵袭转移,是患者术后高复发乃至死亡的主要原因。KiSS
1作为一个肿瘤转移抑制基因,在很多肿瘤的侵袭转移过程中起重要作用[23],但在与肝癌关系的研究中,国内外部分学者发现其与肿瘤转移抑制作用存在相悖[45]。因此深入研究KiSS侵袭、转移及预后的关系很有必要。为此,1, 97H细胞中,获得瞬时表达的细胞株,为后续建立稳定转染的KiSS1高表达阳性细胞克隆奠定基础,为体内外实验研究KiSS细胞增殖、侵袭和转移能力的影响提供前提条件。
1 材料与方法
材料新鲜胎盘组织来源于福建医科大学附属第一医院妇产科正常分娩的胎盘;、;Trizol试剂及脂质体Lipofectamine 2000为美国Invitrogen公司产品;RTPCR逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶(Xho I, BamH I)、T4 DNA连接酶为美国Fermentas公司产品;质粒大量抽提试剂盒为北京Tiangen公司产品
;兔抗人KiSS1为美国Santacruz公司产品;Elivision plus二抗试剂盒为福州迈新生物技术开发公司产品;细胞裂解液为美国Pierce公司产品;PCR引物:根据Gene Bank中查到的KiSS1的mRNA序列,用软件Primer Premier ,由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下(划线部分分别是BamH I和Xho I的碱基识别序列,斜体部分为保护序列):
上游:5′ATGAACTCACTGGTTTCTTGG3′
下游:5′TG3′
方法
重组真核质粒的构建与鉴定
RTPCR扩增目的片段KiSS1基因取50 mg冷冻的新鲜胎盘组织Trizol试剂法提取总RNA,经紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性;所得RNA用Fermentas逆转录试剂盒将其逆转为cDNA,并将其通过PCR法进行扩增,产物行凝胶电泳,目的片段按胶回收试剂盒说明书行胶回收纯化,-20 ℃保存。
KiSS mL离心管中依次加入BamH I 1 μL、Xho I 2 μL、Buffer BamH I 2 μL及KiSS1 DNA 15 μL,37 ℃水浴过夜,加入6×上样缓冲夜4 μL进行琼脂糖凝胶电泳,将酶切的产物胶回收。BamH I、Xho ,步骤同上。将上述回收产物加入如下反应体系:10
×连接缓冲液2 μL,T4 DNA连接酶1 μL,双酶切KiSS1 9 μL, 8 μL,终体积20 μL,4 ℃连接过夜。取上述连接产物10 μL转化至150 ,在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板