文档介绍：武汉东湖学院
生物技术综合实验论文
细菌视紫红质基因的克隆及鉴定
摘要
本实验室通过将视紫红质目的基因(即bop基因)导入pUC18质粒制备得到重组质粒,再将该重组质粒导入到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定,初步证实该实验实现了视紫红质目的基因(即bop基因)的克隆。
本次实验,通过老师提供的大肠杆菌DH5α(含pUC18质粒)菌种平板和大肠杆菌DH5α(不含pUC18质粒)菌种平板进行接种后对比,在氨苄青霉素选择性培养基的筛选作用下,得到了含pUC18质粒的大肠杆菌DH5α;通过SDS碱裂解法制备得到了pUC18质粒,并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定;以实验室老师所提供质粒为模板,进行PCR扩增得到目的基因(带BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点),并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化;在限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的作用下,得到酶切后的pUC18质粒和目的基因,并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化;在T4DNA连接酶的连接作用下,制备出重组质粒;通过氯化钙制备得到感受态大肠杆菌DH5α细胞;在42℃短时间的热冲击处理(热休克)下,重组质粒被感受态大肠杆菌DH5α细胞所摄取,随着大肠杆菌DH5α细胞的增殖而克隆;
为了鉴定重组质粒确实含有视紫红质目的基因(即bop基因),并确实被感受态大肠杆菌DH5α细胞所摄取,并随着大肠杆菌DH5α细胞的增殖而克隆。首先通过SDS碱裂解法提取重组质粒;通过以重组质粒为模板, PCR扩增得到目的基因;然后在1%琼脂糖凝胶电泳中,通过与Maker蛋白的电泳条带对比,进行初步鉴定,得出我们所提取的重组质粒中含有视紫红质目的基因(即bop基因)。为了进一步确定结果,在限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的作用下,我们对重组质粒进行酶切;在琼脂糖凝胶电泳中,通过与Maker蛋白的电泳条带对比,进一步确认出,我们通过大肠杆菌DH5α细胞所克隆得到的重组质粒,确实就是导入了视紫红质目的基因的pUC18质粒。
本次实验的结果:(1)第一次碱裂解法提取质粒后电泳鉴定时,只得到了一条不成带形的“脱尾”亮带,~,推测出这段亮带是不完整的被打断的质粒;第二次碱裂解提取质粒后电泳鉴定时,根据亮带所处位置,,推测出闭合环状的pUC18质粒。(2)PCR扩增得到的目的条带,,亮度较大,带形较宽且连续,推测出该条带是扩增产物,且浓度较大并且纯度较高;在该目的条带下方,出现了模糊的涂抹带,推测出该条带可能是PCR非特异产物带;在碱基数为110bp左右,出现一条模糊带,推测出该条带可能是“引物多聚体”带,也可能是非特异性序列带。(3)经限制性内切酶 BamHⅠ和 HindⅢ处理后,电泳只得到了一条亮带,,即推测为pUC18质粒。(4)通过SDS碱裂解法提取质粒,电泳只得到一条亮带,,推断是重组质粒;通过以重组质粒为模板,PCR扩增电泳得到一条亮带,,推断是目的基因;有“彗星”尾出现,推断是由于没有加入RNA酶。(5)酶切之后的产物出现两条亮带,,,并与酶切之前的重组质粒亮带对比,推测出上面一条带是开环pUC18质粒,下面一条带是酶切后的目的基因。
本次实验的结论:我们通过大肠杆菌DH5α细胞所克隆得到的重组质粒,初步确认就是导入了视紫红质目的基因的pUC18质粒;有关视紫红质目的基因的性状表达,应做进一步的实验鉴定。
关键词:视紫红质基因;pUC18质粒;基因克隆;大肠杆菌DH5α
目录
摘要 1
3
3
基因工程的建立与基本概念 3
3
4
PCR技术 4
细菌视紫红质基因的结构功能与应用 5
实验原理 5
SDS碱裂解法制备质粒及电泳鉴定 5
感受态细胞的制备 6
转化子的筛选 6
整个基因重组试验的基本流程图 7
8
培养基配制、灭菌、无菌接种 8
实验器材和试剂 8
实验方法 8
SDS碱裂解法制备质粒及电泳鉴定 8
实验器材和试剂 8
实验方法 9
PCR扩增目的基因及电泳鉴定 10
实验器材和试剂 10
实验方法 10
PCR产物电泳及回收纯化 10
实验器材和试剂 10
实验方法 11
质粒和目的基