文档介绍：LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用
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【摘要】目的:建立一种环介导等温扩增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)反应快速检测沙门菌的方法。方法:根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(GenBank)上的鼠伤寒沙门菌的特异invA和fimA(登录号:M90846和M18283)基因序列,设计特异引物,提取标本DNA,然后以LAMP技术扩增invA基因,PCR方法扩增fimA基因,采用琼脂糖电泳观察结果。结果:91份血培养阳性报警瓶,LAMP和PCR法检测出阳性18份,与最终培养结果一致;30份粪便标本,LAMP和PCR法检测出阳性5份,培养阳性3份,LAMP测限达到102CFU/mL。结论:LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测临床和环境标本中沙门菌的有效方法。
【关键词】沙门菌环介导等温扩增(LAMP) 核酸
沙门菌(Salmotlella)是肠杆菌科中一种重要的人兽共患病病原菌,是引起伤寒、肠炎等多种疾病的重要病原菌。目前,对于沙门菌的检测普遍采用培养、生化和血清学鉴定等方法,报告阳性结果至少需要3~5天,且较为繁琐、费时费力。而酶联免疫吸附试验、肥达试验、凝集试验、免疫电泳、PCR等方法均存在对检测标准的特殊要求以及特异性方面的不理想等因素[1,2]。我们应用环介导等温扩增(LAMP)反应快速检测沙门菌,报道如下。
1 材料与方法
试剂和仪器核酸扩增仪(MyGetle Thermal Cycler,杭州朗基科学仪器有限公司),Bst DNA聚合酶(New England Biolabs),PCR试剂盒(Takara公司),得灵Walkaway
96全自动细菌鉴定仪,BacT/Alert全自动血培养仪及其配套的血培养瓶(法国生物梅里埃公司产品)。
标本和菌株来源 91份阳性血培养瓶和30份粪便标本均来自温州医学院附属第二医院细菌室。菌株购自卫生部临床检验中心,其它菌株均为温州医学院细菌室临床鉴定菌株。
引物针对鼠伤寒沙门菌的invA和fimA基因(GenBank登录号:M90846和M18283)分别设计特异LAMP和PCR特异引物(上海生工合成)。
阳性血培养瓶中细菌DNA模板提取采取盐酸胍苯甲醇法[3]:①,然后加入5M盐酸胍缓冲液100μl,涡旋振荡5min;②依次加入400μl双蒸水和800μl苯甲醇,涡旋振荡1min,然后在4℃下以700×g离心5min;③,依次加入3M醋酸钠缓冲液40
,然后在4℃T 16,000×g离心15min;④倒掉上层液体,加入1ml 70%乙醇洗涤,然后在4℃T 16,000×g离心10min,接着倒掉上层的乙醇,待自然干燥后加入100μl双蒸水溶解管底的DNA沉淀备用。
粪便标本细菌DNA直接提取按照文献[4]进行。
绵羊血琼脂平板上菌株的DNA提取挑取1个以上纯菌落置入内含100μl裂解液(蛋白酶K浓度为200ng/