文档介绍：p27和TGFβ在大鼠肾间质纤维化中的表达及关系
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的: 研究单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织p27的表达, 同时观察TGFβmRNA在各组的变化, 探讨UUO模型中 TGFβ与p27的关系。方法: 60只SD大鼠随机分成假手术组(SOR)、 UUO模型组。于术后第7、 14、 21天分别处死各组大鼠10只。用HE染色动态观察肾脏病理变化, 免疫组织化学法测定p27的蛋白表达及动态变化, RTPCR法测定p27mRNA和TGFβmRNA的水平。结果: SOR组肾小管上皮细胞p27蛋白及肾皮质p27mRNA的表达均强, UUO组随着间质纤维化程度的加重, p27的表达逐渐减弱, 而TGFβmRNA随着肾间质纤维化程度的加重, 其表达呈上升趋势; UUO组TGFβmRNA与p27mRNA成负相关。结论: p27参与了UUO大鼠肾间质纤维化的发病过程; UUO大鼠肾间质纤维化模型中TGFβ促纤维化机制可能与p27的下调相关。
【关键词】 p27 转化生长因子β纤维化肾脏
肾间质纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病进行性发展的最终共同通路, 是导致终末期肾病的主要病理基础。研究表明, 间质成纤维细胞及肾小管上皮细胞的异常增殖及凋亡, 造成细胞外基质(extracellular matrix)过多, 参与了肾间质纤维化过程[1]。近年来研究发现, 调节细胞增殖与凋亡的最终环节发生在细胞周期水平上, p27是一种细胞周期素依赖性激酶抑制剂, 它通过影响细胞周期基本过程来调节细胞的生长, 并可影响细胞凋亡[2]。众所周知, 转化生长因子
β(TGFβ)是目前公认的促纤维化发生、发展的关键因子之一, 且可通过诱导肾小管上皮细胞凋亡, 导致肾小管萎缩致肾间质纤维化[3]。而在肾间质纤维化过程中, p27的功能与TGFβ有关[4]。本研究中我们动态观察单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化模型中肾组织p27表达的变化, 同时观察TGFβ与p27的关系, 探讨慢性肾间质纤维化的发病机制, 并为其防治提供新的思路。
1 材料和方法
材料小鼠抗大鼠p27单克隆抗体(mAb)购自美国Neomarker公司; KIT9001免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司; 逆转录试剂盒、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP均购自美国Fermentas公司; p27及βactin引物, TGFβ及GAPDH引物均由上海生工生物工程公司合成。健康雌性SD大鼠均由中南大学湘雅医学院动物学部提供, 共60只, 月龄2月左右, 体质量(200±20)g, 生长良好, 普食喂养。
方法
动物的分组及单侧输尿管梗阻模型的建立实验动物随机分为假手术组(sham
operated rats, SOR, n=30)和单侧输尿管结扎手术组(unilateral ureteral obstruction, UUO, n=30)。单侧输尿管结扎手术组造摸方法是在无菌条件下行大鼠左侧输尿管结扎术, 假手术组除不结扎离断输尿管外余处理同手术组。分别于手术后第7、 14、 21天每组各处死10只大鼠留取左肾标本。
免疫组化染色采用SP法。4 μm石蜡切片脱蜡水化后经30 mL/L过氧化氢孵育25 min封闭内源性过氧化物酶, 微波修复15 min。羊血清封闭30 min后, 加入一抗(小鼠抗大鼠p27 mAb, 稀释浓度为1∶50)37℃孵1 h, 再依次加入抗原加强液及二抗(羊抗小鼠IgG); DAB显色, 苏木素复染后, 中性树脂封片。每次染色均用PBS替代一抗作为阴性对照, 用已知乳腺癌组织做阳性对照。
肾组织p27mRNA和TGFβmRNA的表达测定总RNA提取及逆转录按试剂盒说明步骤进行。p27: 上游引物5′TGG3′, 下游引物 5′GGGTTCTTCTTGGGCG3′, 扩增长度为 560 bp, 根据文献设计[5]。βactin: 上游引物 5′AAGTCATCACTATTGG3′, 下游引物5′TGC3′, 扩增长度为360 bp, 根据GenBank设计。TGFβ: 上游引物5′AAAGAAG3′, 下游引物5′ACTCAGG3′扩增长度294 bp, 根据文献设计[6]。GAPDH: 上游引物5′ACGGCAAGTTCAAT3′, 下游引物5′GGATGCAGGGATGATGTTCT3′扩增长度501 bp, 根据GenBank, 用primer3软件辅助设计。 mL的PCR反应管中依次加入下列反