文档介绍：SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:鲍海逊,夏梅,缪凤琴,谢维,张建琼
【摘要】目的: 表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb)。方法: 原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段,从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白(N端205至419aa)基因片段,测序结果正确。将该基因片段插入pQE30中,构建重组质粒pQE30S1m, M15诱导表达HisS1m蛋白。纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb。结果: 表达并纯化了重组蛋白HisS1m,获得1株抗HisS蛋白的mAb1H2。Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型。经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应,而与His蛋白无交叉反应。结论: 成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARSCoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。
【关键词】严重急性呼吸综合征;SARS 冠状病毒;S蛋白;单克隆抗体
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是2002 年11 月爆发流行的一种新的传染病,该病传染性强,潜伏期短,进展快,死亡率高[1
2]。尽管目前SARS 疫情已得到控制,但仍存在复发的可能。因此,研制预防、诊断和治疗的方法具有重要意义。SARS 病原体的分离和鉴定研究表明,SARS冠状病毒(coronavirus)(SARSCoV)是一种新型的冠状病毒。其主要结构蛋白有S、E、M 和N,其中S蛋白是Ⅰ型膜糖蛋白(基因全长3 768 bp,编码1 255个氨基酸),在功能上可分为S1和S2:N端为亚单位S1,构成成熟刺突蛋白球部分;C 端为亚单位S2,形成细长突起的柄部分。S蛋白在病毒与宿主细胞表面受体结合及介导病毒进入细胞的过程中起关键性作用。SARSCoV S蛋白识别宿主细胞上的受体与其它冠状病毒不相同,它主要是通过血管紧张素转换酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)作为其功能受体[34]。Wong等[4]发现S1的12~327 aa 和12~481 aa 不与ACE2结合,但S1的318~510 aa的193氨基酸区域可以有效地结合ACE2。此外,S蛋白是冠状病毒的主要抗原,其上有许多病毒抗体中和位点,研究证实S蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要成分,是用来研制保护性疫苗的最理想部位[57]。
本实验用PCR方法,以SARS病毒cDNA为模板,扩增S1m蛋白(N端613至1 256 aa)的基因片段,表达重组蛋白S1m,纯化后免疫BLAB/c小鼠,制备了单克隆抗体,以期为SARSCoV的早期检测、进一步研究S蛋白的功能奠定基础。
1 材料和方法
材料
1.
SARS病毒cDNA 由北京华大基因有限公司提供。
菌株、质粒 M15、DH5α和质粒pQE30均为本实验室保存。
实验动物、细胞 BALB/c小鼠由本校动物中心提供;SP2/0小鼠骨髓瘤细胞为本实验室保存。
试剂 ExTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司。BamH Ⅰ、Hind Ⅲ购自MBI公司,LB 固体、液体培养基、Ampicilin 由本实验室配制。DNA 回收试剂盒等购自Qiagen 公司,GeneRulerTM 1 kb DNA ladder 购自MBI公司。BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司,羊抗鼠抗体购自中山公司。引物合成及测序由上海申能博采公司承担。弗氏完全和不完全佐剂、新生牛血清及HRP羊抗鼠IgG均购自Sigma公司,HAT 及HT、PEG 购自南京医科大学,小鼠Ig亚型测定试剂盒( Isotrip kit)购自Boehringer Mannheim公司。RPMI 1640培养基购自Gibco公司。ECL显色底物均购自Pierce公司。PVDF 膜购自Schleicher Schull公司。针对S1m蛋白设计PCR上游引物为5′TTC3′,下游引物为5′ATGAAATCATCTGG3′(划线部分为酶切位点)。
方法
S蛋白基因片段的获得和重组质粒的构建以SARS病毒cDNA为模板,利用特异性引物,经PCR获得S蛋白(N端205至419 aa)基因片段,利用BamH
Ⅰ、Hind Ⅲ酶切位点,将目的基因插入质粒载体pQE30中, DH5α,扩增并提取质粒。重组质粒经Hind Ⅲ和