文档介绍：河北医科大学
硕士学位论文
SARS冠状病毒Spike蛋白基因片段DNA疫苗及免疫效果研究
姓名:谢力
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:赵瑞景
20050301
中文摘要
冠状病毒蛋白基因片段疫苗及免疫
效果研究
摘要
目的严重急性呼吸道综合征
是一种急性呼吸道传染病,亦称为非典型
肺炎。年底,我国广’东省首先出现了有记录病例,
继而在年初传播到世界多个国家,持续流行长达
个月,造成将近人被感染,人死亡,死亡率超过

的病原体被确认为是一种新型冠状病毒,称为
冠状病毒毫无疑问,给
大众健康和社会经济造成了巨大的损失。虽然在第一
次流行过后再罕有病例发生,但是,鉴于病毒具有多
种传播途径和厂“泛的包括一些野生动物在内的非人类中间
宿主,很有可能在将来再次暴发。目前,我们还没有
针对的特效抗病毒药物或者疫苗。为了预防和控制今
后的流行,研制针对冠状病毒的新型疫苗势在
必行。
是基因组全长约的单股正链病毒,
属于冠状病毒属,和其他冠状病毒类似,的病毒基
因组有个开放读码框架和个潜在的开放读码框
架,这些开放读码框架编码的蛋白包括聚合酶蛋白
、刺突蛋白、小包膜蛋
白、基质蛋白
和核衣壳蛋白。在这些病毒蛋白中,
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蛋白可与易感细胞受体结合并介导膜融合使病毒能够进入
到易感靶细胞内。因此,蛋白在病毒感染中发挥重
要作用,而且是和中和抗体发生结合反应的首选靶位。
鉴于针对的免疫可能是一种有效诱导机体
保护性体液免疫和细胞免疫的方法蛋白在病毒感
染及诱导机体免疫应答中发挥重要作用,本研究选取编码
冠状病毒蛋白的两个基因片段,其中一个是我们认
为极有可能作为疫苗开发的含受体结合域的基因片
段,分别用它们作为目的基因构建质粒,用质粒作为
核酸疫苗免疫小鼠,检测小鼠体液及细胞免疫反应情况,旨
在探索疫苗作为未来疫苗的可能性,为进一步
阐明冠状病毒诱导机体免疫应答机制及病毒
疫苗的研制奠定基础。
方法本实验选择编码病毒蛋白基因上第
位碱基和包含靶细胞受体结合区的第
位碱基作为目的基因分别命名为和通过设计特
异性扩增引物用方法扩增和基因片段,克隆
并连接至载体构建
酶切回收目的基因片段,分别与真核表达载体连接,
构建真核表达质粒,转化
大肠杆菌,在含卡那霉素的培养基
上筛选阳性重组子,经及双酶切鉴定后,体外转染
非洲绿猴肾细胞和人胚肾细胞,观察其在真核细胞
的表达大量提取及纯化两种重组质粒
小鼠只随机分为组每组只,
将构建的种重组质粒经肌肉注射
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免疫小鼠,每次注射剂量为留只,体积为共免
疫三次,每次免疫间隔周,对照组小鼠用相同方法注射同
样剂量的空质粒。第三次免疫后天,处死小鼠,
收集各组小鼠血清,用病毒裂解物和原核表达的
蛋白作为诊断抗原,经酶联免疫吸附试验
,检测特异性抗体产生情况
并进行微量中和试验分离各组小鼠脾细胞,经流式细胞仪
检测其不同业群细胞构成比,酶联免疫斑点
方法检测受特异性抗原刺激后
的产生情况口
结果以含编码病毒蛋白全基因序列的
质粒为模板,用自行设计的两对特异性引物,经可获
得两条左右的目的基因片段和所构
建的真核重组质粒经和双酶切,
琼脂糖凝胶电泳观察均可显示左右的电泳条带
重组质粒内插入片断序列经测序结
果与中株的基因序列进行同源性比较,其
序列完全一致。构建的质粒
能在非洲绿猴肾细胞和人胚肾细胞中成功表
达蛋白。将质粒
作为疫苗免疫小鼠,检测结果显示,
两组质粒免疫小鼠产生的抗体均可与全病毒裂解
产物和大肠杆菌表达的基因片段产物蛋白发生特异
性结合反应血清微量中和试验结果显示,只
免疫组小鼠血清均具有中和抗体,其平均中和滴度为
,而免疫组和空质粒对照组小鼠血
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清则没有中和活性流式细胞分析发现,和
质粒免疫组小鼠脾细胞十细胞构成比均高
于空质粒对照组检测结果显示,两
重组质粒组免疫小鼠分泌的脾细胞数均高于空
质粒对照组,与对照组间有统计学意义

结论本研究选取蛋白基因上第
位碱基和包含靶细胞受体结合区的第位碱基两
个基因片段作为目的基因进行克隆,成功构建了其真核表达
质粒分别用
可检测到两种真核表达质粒
在哺乳动物细胞中的表达,且表达形式均为分泌性表达。提
示构建的两种真核表达质粒均能在
真核细胞中成功表达。用质粒
作为疫苗肌肉注射免疫小鼠,检测小
鼠血清均产生了针对的较高滴度的特异性