文档介绍：siRNAID1对人肝癌细胞HepG2中ERK信号通路的影响
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【摘要】目的观察siRNAID1转染人肝癌细胞HepG2细胞后对肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响及其对ERK1/2通路的作用。方法实验分为4组,即空白对照组、转染试剂组、转染对照组及转染siRNAID1组。阳离子脂质体法介导siID1转染肝癌细胞后,唑蓝比色法(MTT)观察HepG2细胞增殖情况。分别用反转录聚合酶链式反应法(RTPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测转染后pERK1/2、ERK1/2 mRNA与蛋白表达的情况。结果转染siRNAID1的HepG2细胞增殖速度明显减慢()。转染后ERK1/2及pERK1/2 mRNA表达降低();pERK1/2蛋白的表达较空白对照组明显降低(),ERK1/2蛋白表达空白变化不明显。结论 siRNAID1转染HepG2细胞后可明显抑制细胞的增殖,使得ERK1/2基因表达活性下降,提示ID1有可能通过ERK1/2信号转导通路介导,促进肝细胞癌HepG2细胞的增殖。
【关键词】抑制因子,免疫; 丝裂原激活蛋白激酶类; 细胞外信号调节MAP激酶类; 肝肿瘤; 转染; 信号传导; 氮蓝四唑; RNA,小分子干扰
近期发现,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号途径的激活可能是DNA结合抑制因子
1(inhibitor of differentiation/DNA binding1, IDl)诱导细胞增殖的一个机制[1]。与正常组织相比较,肝癌组织中的MAPK通路上的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)都是处于高表达及高活性状态。若使用其ERK抑制剂就可以减缓细胞的增殖及引起细胞的凋亡[2]。本研究通过小分子干扰RNA技术使ID1基因沉默,观察其对HepG2细胞增殖的影响及其对ERK1/2 mRNA及蛋白表达的影响,探讨ERK1/2及其信号转导途径与肝癌发生发展的关系。
1 材料和方法
材料人肝癌细胞株HepG2细胞(上海科学院细胞中心);siRNA试剂(广州锐博生物有限公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT,厦门泰京生物有限公司);逆转录聚合酶链反应(RTPCR)试剂盒(美国Fermentas公司);PCR引物由上海鼎安生物科技有限公司合成;兔抗人ERK1/2多克隆抗体,兔抗人pERK1/2多克隆抗体,辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司)。
分组分为4组,即空白对照组(正常培养HepG2细胞组);转染试剂组(即仅加入Lipofectamine 2000组;转染对照组(即转染非特异性序列control siRNA组);转染siRNAID1组。
方法
siRNA的设计和合成 siRNA
ID1由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。
靶序列:5’TGAGCAAGGTGGAGATTCT3’
正义链:5’UGAGCAAGGUGGAGAUUCU dTdT3’
反义链:3’dTdT UCUAAGA5’
细胞的培养与转染细胞常规培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基,于37 ℃、。取对数生长期细胞,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(无抗生素)将消化后的HepG2细胞制备成细胞悬液;调整细胞浓度为1×107 L-1,接种于细胞培养板内(6孔加入2 mL,每孔2×104细胞),培养24 h。参照说明书建议,将siRNA浓度稀释为50 nmmol/L,阳离子脂质体法介导siRNAID1转染肝癌细胞。存放24 h后备检测。
MTT法测定细胞增殖将对数生长期细胞接种于96孔板,每组设4个复孔,分别于培养24,48,72,96 h后;每孔加入20 μL MTT(5 g/L),继续培养4 h。弃去上清,每孔加二甲基亚砜(DMSO)150 μL,平板摇床震摇10 min,酶联免疫检测仪测定490 nm处的吸光度(OD值)。
细胞增殖抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值
RTPCR检测ERK1/2及pERK1/2 mRNA的表达水平用Trizol提取总RNA,反转录成cDNA。(1)内对照
β肌动蛋白(βactin),扩增片段556 bp;循