文档介绍：siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:缪应业,刘新,李浩,乔卿华,侯林虎,刘小圆,郝晓柯
【摘要】目的: 构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(KDR)基因的shRNA表达载体,研究KDR基因沉默后对PC3细胞的增殖、生长的影响. 方法: 将合成的三对DNA正义链及反义链变性、退火,H1 neo线性质粒用T4 DNA连接酶连接,KDR1, KDR3三个siRNA表达载体. 经酶切及DNA测序鉴定后,采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞,通过RTPCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测KDR的表达变化,MTT法检测细胞生长速度的变化,流式细胞仪检测细胞周期的变化,NC的PC3细胞为对照. 结果: 酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体. RTPCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明,KDR3有效地降解了PC3细胞中KDR基因的mRNA,下调蛋白表达;
KDR3后PC3细胞生长速度明显变慢. 结果表明, KDR3组PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高,而S期和G2M期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(). KDR2无效. 结论: 成功构建针对KDR基因的siRNA表达载体,KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌细胞系PC3细胞中的表达,抑制PC3细胞的增殖.
【关键词】 RNA,小分子干扰;血管内皮生长因子受体;PC3细胞;前列腺肿瘤
0引言
血管内皮生长因子受体Ⅱ,又称激酶功能区受体(vascular endothelial growth factor Ⅱ, VEGFR2/kinase domain receptor, KDR),其在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达,对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用,在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用. 研究表明,人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达,存在VEGFKDR自分泌途径,与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关[1-2]. H1 neo在前列腺癌细胞系PC3内表达针对KDR基因的短发卡状RNA(short hairpin small interfering RNA, shRNA), 阻断或降低细胞中KDR基因的表达, 探讨KDR基因沉默后对PC3细胞增殖、生长的影响.
1材料和方法
H1 neo质粒(美国Ambion公司);Lipofect
M2000转染试剂(美国Invitrogen公司);PC3细胞株为本室保存;鼠抗人KDR mAb, 羊抗鼠二抗,DAB显色液(武汉博士德公司);GAPDH内参及其mAb(上海康成生物有限公司); pEGFPN2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.