文档介绍：SurvivinsiRNA真核重组质粒的构建和鉴定及其对前列腺癌DU145细胞的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:刘艳波葛贺卢丽莉赵雪俭
【摘要】目的应用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对凋亡抑制因子survivin的siRNA,并检测其对DU145细胞株内源性survivin基因和蛋白表达的影响。方法构建重组质粒shRNAsur1和sur2并分别转染 DU145细胞株,通过半定量 RTPCR和Western印迹检测survivin mRNA转录水平和蛋白表达的变化。结果成功构建针对survivin干扰的两种真核表达质粒;两种重组质粒shRNAsur1和sur2均能明显抑制内源性survivin基因表达,其抑制率分别为72%±8%和77%±5%;两种质粒均能明显抑制survivin蛋白的表达,其抑制率分别为75%±8%和80%±6%。结论重组质粒shRNAsur1和sur2均可明显抑制DU145细胞内源survivin 蛋白表达和mRNA转录,为survivin介导的肿瘤基因沉默提供良好的基础。
【关键词】 siRNA;DU145细胞株;survivin 基因;质粒
survivin是1997年发现的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族的一个新成员,仅特异性表达于人和鼠胚胎发育组织及多数人类肿瘤组织,在正常成人组织几乎不表达〔1〕。有研究表明:survivin基因在前列腺癌中高表达,其在前列腺组织中再激活和异常表达而导致细胞凋亡减少,参与了前列腺癌发生、发展,survivin蛋白表达和前列腺癌细胞凋亡呈负相关〔2〕。使得应用RNA干涉技术沉默Survivin基因成为可能。小干扰
RNA (siRNA) 技术是目前简单而高效阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法。本实验选择和设计针对survivin基因siRNA靶序列,通过人工合成靶序列后构建表达siRNA靶序列载体,并转染前列腺癌DU145细胞,观察siRNA能否诱导DU145细胞内源性survivin表达沉默,为体内外实验提供实验基础。
1 材料与方法
材料人激素非依赖性前列腺癌DU145细胞株,为吉林大学前列腺疾病防治研究中心传代保存;大肠杆菌JM109为本中心保存;质粒pGCsiU6/Neo/GFP购自上海吉凯基因化学有限公司;各种分子克隆工具酶为TaKaRa产品,DNA纯化试剂盒、RTPCR试剂盒、去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒和小量DNA切胶回收纯化试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品;IMDM培养基为美国Hyclone公司生产,新生牛血清购自北京鼎国公司;转染试剂Lipofectamin2000购自Invitrogen公司,兔抗人survivin抗体及羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司,蛋白定量试剂盒为BioRad公司产品;其他试剂为进口或国产分析纯。DNA片段及序列测定均由上海生工生物公司完成。
方法
Survivin siRNA模板寡核苷酸设计按siRNA设计原则,从GeneBank(NM001168)中寻找符合survivin mRNA特异靶序列,并用RNA ,最终确定了两条DNA 寡核苷酸链:(1)shRNA
sur1针对其编码区166~184位碱基序列,其对应开放阅读框架序列为45~63;核苷酸序列为5′TTTTTGGAT3′(正义),5′AGCTA GG3′(反义);(2)shRNAsur2针对其编码区394~412位碱基序列,其对应开放阅读框架序列为273~291,5′ TTCAAGAGA GGTTAATTCTTCAAACTGCTTTTTGGAT3′( 正义),5′AGCTA TCTCTTGAA GGTTAATTCTTCAAACTGC GG3′(反义)每条正义链包括5′末端BamH Ⅰ酶切位点和反向的两个一致的靶序列(19 bp),两个靶序列之间被9个非同源序列(TTCAAGAGA)所间隔。3′末端加有TTTTT以及Hind Ⅲ酶切位点;同时设计对照质粒,5′GTATAAGTCAACTGTTGAC TTCAAGAGA GTCAACAGTTGACTTATACTTTTTTGGAAA3′(正义),5′ AAAAAAGTATAAGTCAACTGTTGACTCTCTTGAAGTCAACAGTTGACTTATACG3′
(反义)由上海生工公司合成。
构建重组质粒pGCsilencerU6siRNAsurvivin 首先将pGCsilencerU6/Neo/GFP质粒用BamH Ⅰ及Hind Ⅲ消化,凝