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陕西医学杂志年月第卷第期
一一融合蛋白的原核表达及纯化△
郧阳医学院附属太和医院麻醉科十堰
周龙王立林朱明磊王家宁一黄永章一严世荣
摘要目的:构建融合蛋白一一的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯
化。方法:通过方法自一质粒中扩增基因,克隆入中间载体
—。经和双酶切后,构建原核表达载体~一一,
经测序证实构建成功后转化。,表达一融合蛋白,经—
树脂亲合层析,纯化产物进行—及分析鉴定。结果:成功构建一一
融合蛋白原核表达载体,×。的一一融合蛋白。
结论:一一融合蛋白表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用细胞周期抑
制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究提供了理论基础。
主题词蛋白质类/分离和提纯

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体内天然存在的也称野生型,它作为是由野生型位苏氨酸和
一种细胞周期素依赖性激酶抑制因子,通过与位脯氨酸分别置换成蛋氨酸和异亮氨酸产生。
细胞周期素和细胞周期激酶结合,参缺乏位苏氨酸功能基团羟基,不能被
与细胞周期的负性调控,在细胞增殖、分化和凋亡等活磷酸化而很难经泛素一蛋白酶降解途径识别降解,所
动中扮演重要角色。被认为是人类多种肿瘤独以的半衰期为,远远长于的半衰
立的预后因子和未来可能的肿瘤治疗靶点。/ 期。实验证实较具有更强大的抑瘤作
磷酸化的一残基,导致通过用。这种蛋白分子量为,不能自由穿过细胞膜,
泛素连接酶途径被降解。突变型如果能提高细胞中蛋白浓度,则有望开辟一种新型有
效的抑癌途径。
△湖北省教育厅资助项目近年研究发现有一类短肽能携带多种外源大分子
通讯作者物质进入细胞,具有高效不耗能,无组织特异性等优
郧阳医学院生物化学教研室点,研究者将它们命名为细胞穿透肽—
郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所
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陕西医学杂志年月第卷第期
,,也称蛋白转导域加产物与’末端带有胸腺嘧啶的—
,。一是一种人工合成由连接酶连接。连接产物转化
的细胞穿膜肽,为个氨基酸残基组成的兼性肽段, ,用/氨苄//—平板进行蓝自斑筛
不仅可以运载变性蛋白人胞,还可以运载天然构像蛋选,挑取白色克隆菌大量扩增,碱裂解法提取—
白人胞。运载的方式灵活多样,可与外源大分子共价键—,和酶切鉴定。人工合成编
连接介导人胞,还可直接以相应比例混合使外源大码一
分子进入细胞。本研究构建—一一融个氨基酸的两条寡核苷酸片段,退火后形成一条寡聚
合蛋白重组表达质粒,在大肠杆菌中进行诱导表达,通核苷酸双链,双链两端分别是限制性内切酶和
过纯化得到具有促凋亡能力蛋白与细胞穿透肽的酶切位点。用和双酶切,
一组成的融合蛋白一一,为进一步研究低熔点琼脂糖回收的片段。两
细胞穿透肽携带外源物质人胞及探索肿瘤治疗新途径条片段用连接酶于℃连接过夜,次日
奠定实验基础。转化感受态细菌。用含./氨苄霉素的
材料与方法平板筛选阳性克隆,小量提取质粒后,用和
材料酶切鉴定。重组质粒—一与—
. 菌株及质粒—载体系统为—用和双酶切,