cre loxp基因敲除系统解读ppt课件.ppt

文档介绍：基因敲除KnockOut*背景介绍1981年Evans等首次在体外分离和培养ES,成功建立了小鼠胚胎干细胞系1985年Smithies最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组*同源重组bination同源重组是指发生在姐妹染色单体(sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中,需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组同源重组示意图同源重组示意图*一、Cre/Loxp系统Cre重组酶(37℃)位点特异性重组酶,介导loxp位点间的序列同源重组70%重组率,无需辅助因子,多种结构的DNA底物Loxpsite34bp反向重复序列Flp/Frt重组系统P1噬菌体*(1)重组方式*(2)基因敲除机理Offspring:50%heterozygousknockoutafter1generation*基因敲除机理(续)Offspring:25%homozygousknockoutafter2generation*二、基因敲除的基本流程*(1)打靶载体构建ConditionalKnockoutExon13NGT/AGAttention:*(2)转化ES细胞电穿孔或是显微注射方法将构建好的打靶载体导入ES细胞电转需要的细胞数量2-5x107*